單核/巨噬細胞自噬在肝病中的作用研究進展

李敏，沈琴，王曉萍，強磊

(中國藥科大學基礎醫學與臨床藥學學院，江蘇 南京 211198)

肝臟作為機體重要器官之一，發揮著代謝調控、營養儲存和解毒作用，肝臟的免疫功能對維持組織和機體的穩態至關重要。當肝臟免疫失調時，來自外界具有危險性的刺激或適當免疫機制會導致病理性炎癥，機體更易受到慢性感染、自身免疫性疾病和惡性腫瘤相關的肝臟疾病的侵擾[1]。肝臟巨噬細胞因其在體內穩態平衡和肝病中的重要作用受到越來越多的關注。枯否細胞(Kupffer cells，KC)是肝臟駐留巨噬細胞[2]，約占肝臟非實質細胞的35%，具有“哨崗”功能，在肝臟發生病變時，促炎性單核細胞會轉變為巨噬細胞(monocyte derived macrophage，MDM)并大量涌入肝臟組織，參與肝病的發生發展[3-4]。自噬在肝臟中的作用已有眾多研究[5-7]，而巨噬細胞自噬在肝病中的作用是目前的研究熱點。與自噬在其他疾病中的作用具有兩面性不同[8-9]，巨噬細胞自噬在肝臟相關疾病中發揮的保護作用被人們視作治療肝病的潛在重要手段。

本文主要綜述了自噬的過程、自噬對巨噬細胞功能的調控作用以及巨噬細胞自噬在不同肝臟相關疾病發生發展中的作用。

1 自噬的過程

細胞自噬是一種機體必要的、保守的過程。在此過程中，包括可溶性蛋白質、細胞器、大分子復合物和外來異物等在內的細胞中各種成分進行自我降解和代謝，俗稱為“自食”(self-eat)[10]。這種細胞內代謝過程在機體穩態中發揮必不可少的作用，其功能障礙參與了多種疾病的發生發展，例如癌癥、感染性炎癥以及心血管疾病等[11-14]。細胞自噬發生過程有5步[15-17]：①自噬誘導：雷帕霉素靶蛋白復合物1(mechanistic target of rapamycin complex 1，mTORC1)活性被抑制，觸發自噬相關基因(autophagy-related genes，ATG)13-ATG1/ULK1(Unc-51 like autophagy activating kinase)-ATG17復合物形成并啟動自噬[18-19]；②成核：Ⅲ類磷酸肌醇3激酶(class Ⅲ phosphoinositide 3-kinase，PI3K/Vps34)-ATG6/Beclin1復合物介導前自噬體結構(pre-autophagosome structure，PAS)形成；③自噬體延伸：ATG12-ATG5-ATG16復合物在泛素活化酶E1和E2樣酶ATG7和ATG10的作用下形成，LC3/ATG8前體經由加工修飾為LC3-I和LC3-II，參與自噬體膜的延伸擴張；④自噬體成熟[20]：自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，內吞體分選復合物(endosomal sorting complexes required for transport(ESCRT)、Ras樣GTP酶(Ras-like GTPases，Rabs)[21]、溶酶體相關膜蛋白1(lysosomal-associated membrane protein1，LAMP1)、LAMP2等參與了此過程⑤自噬體裂解。有兩種基因修飾小鼠模型可用于自噬的體內研究：“自噬缺失小鼠”和“自噬監測小鼠”[22]。評價自噬在體內發揮的作用與自噬過程監測對于更好地利用自噬診斷和治療人類疾病具有重要意義。

2 自噬在單核/巨噬細胞中的作用

在機體穩態生理條件下，單核/巨噬細胞普遍存在于各種組織和體腔中，是先天免疫的重要組成部分之一，參與多種慢性炎癥和相關病理過程[23-24]。有研究表明，集落刺激因子2(colony stimulating factor 2，CSF2/GM-CSF)可激活mTOR信號通路，抑制自噬，從而促進小鼠髓系祖細胞分化為巨噬細胞(見圖1)[25]；小鼠造血系統敲除Atg7(Atg7flox/flox;Vav-Cre)可導致循環外周血和組織駐留髓祖細胞數量增加[26-27]。以上結果都證明抑制自噬可以促進造血干細胞和祖細胞分化為巨噬細胞。然而，小鼠髓系敲除Atg7(Atg7flox/flox;Lyz-Cre)與野生型小鼠相比外周血并無明顯骨髓增殖，可能是由于髓系細胞僅限于粒細胞、單核細胞和成熟巨噬細胞，而包括干細胞和祖細胞在內的早期造血干細胞仍舊保持了完整的Atg7等位基因[28]。另外有研究表明自噬阻止了單核細胞的凋亡，促進了單核細胞分化為巨噬細胞[29]。可見自噬在巨噬細胞成熟分化的不同階段起到了不同的作用，具體機制有待進一步闡明。

圖1 自噬對骨髓來源的巨噬細胞功能的調控

自噬除了與巨噬細胞的成熟分化相關外，也對其誘導極化具有重要意義。骨髓來源的巨噬細胞(bone marrow derived macrophages，BMDM)向M2型極化依賴于自噬，并由核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)自噬性降解介導，該過程依賴p62/SQSTM1[30-31]。Roca等[32]的研究發現腫瘤微環境中趨化因子2(CC chemokine-2，CCL2)和白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)增強了自噬，促進了人外周血來源的髓系細胞發生M2表型極化。此外，在腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAM)的研究中發現，溶酶體蛋白酶組織蛋白酶S介導的自噬促進TAM向M2極化，有助于腫瘤生長和轉移，加速腫瘤惡化[33]。然而，自噬直接調節巨噬細胞極化相關信號通路，還是調節巨噬細胞極化過程中關鍵蛋白質的降解，仍需進一步探究。

自噬還會影響巨噬細胞相關蛋白質的分泌和表達。巨噬細胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)是一種由巨噬細胞表達的促炎性細胞因子。巨噬細胞Atg5被抑制后，由單核細胞和巨噬細胞分泌的MIF增多，此過程依賴于線粒體活性氧[34]。Atg5flox/flox;Lyz-Cre小鼠在受到結核桿菌感染后IL-1α、IL-12和CXC趨化因子1(C-X-C Motif Chemokine Ligand 1，CXCL1)都升高，但是公認的促炎性細胞因子干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)、IL-6和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)卻沒有改變[35]。可見，自噬在細胞因子的產生過程中并非一般炎癥刺激的結果，可能與更具體的機制相關。

3 巨噬細胞自噬參與肝臟相關疾病的發生發展

3.1 肝損傷 肝損傷發生時除了對肝細胞造成首要直接損害外，還會引起諸多免疫反應引發的細胞因子的釋放[36]。盡管KC和MDM介導了肝損傷后的組織重塑和修復，巨噬細胞的過度激活仍舊是形成肝細胞損傷的基礎[1,37-38]。

內毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性菌內毒素重要成分，可直接或間接參與包括肝炎在內的多種肝病的發病進程；D-半乳糖胺(D-galactosamine，D-GalN)會引起肝彌漫性壞死和肝臟炎癥，和臨床病毒性肝炎的病理性變化相似。LPS/D-GalN誘導的急性重癥肝炎常作為一種動物模型用于研究急性肝損傷的生理、毒理機制[39-40]。有研究表明，相比野生型小鼠，LPS/D-GalN誘導的急性肝損傷在Atg5flox/flox;Lyz-Cre小鼠中表現的更為嚴重，血清IL-1β明顯升高，阻斷IL-1β受體信號通路后肝損傷減輕，巨噬細胞自噬可通過抑制炎癥小體依賴性IL-1β的產生抑制LPS/GalN誘導的急性肝損傷[41]，該自噬過程受生長阻滯特異性蛋白6(growth arrest-specific protein 6，GAS6)-受體酪氨酸激酶AXL調控[41]。此外，巨噬細胞中窖蛋白(caveolin-1，Cav-1)介導的Notch1/HES1(hairy/enhancer of split 1)信號通路的激活對自噬的調控介導了超順磁性葡聚糖氧化鐵納米顆粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs)對巨噬細胞IL-10分泌的促進作用，抑制了炎癥，改善了LPS誘導的肝損傷[42]。在硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA)誘導的急性肝損傷中，KC沉默Atg5后，促炎因子分泌升高，KC向M1型極化，精胺(spermine，SPM)刺激KC自噬水平升高，抑制其M1極化，從而改善了肝損傷[43]。

酒精性肝病(alcoholic liver damage，ALD)是一個復雜的過程，酒精性肝炎是所有ALD中最嚴重的一種[44]，ALD動物模型主要表現為脂肪變性和中度炎癥，而人類患者惡化為肝硬化甚至是肝衰竭才會被患者發現。酒精會影響自噬過程中的多個基因，干擾自噬流[45-46]。KC在慢性酒精誘導的早期肝損傷中起到至關重要的作用。給予小鼠KC抑制劑GdCl3可部分顯著改善肝功能，減少脂滴蓄積[47]。大麻素受體2(cannabinoid receptor 2，CBR2)對酒精誘導的肝損傷的保護作用是通過對KC的激活調節實現的，其通過血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)誘導的自噬依賴途徑抑制肝臟炎癥反應改善肝損傷[48]，CB2激動劑在Atg5flox/flox;Lyz-Cre小鼠中對肝臟的保護作用被逆轉強調了巨噬細胞自噬的必要作用。酒精喂養小鼠6周后，Atg7flox/flox;Lyz-Cre小鼠表現為更嚴重的線粒體活性氧產生過剩，IL-1β、CCL5、CXCL10分泌增加和脂肪病變[49]。機制研究表明，胞內干擾素調節因子(interferon regulatory factor，IRF)水平受到降解性自噬調節，而由TLR4-TRIF介導的IRF的表達可調節CCL5和CXCL10的分泌[49]從而影響肝損傷進程。

3.2 肝纖維化 肝纖維化關鍵環節為肝臟星狀細胞(hepatic stellate cells，HSC)的激活[50]，細胞外基質(extracellular matrix，ECM)過度蓄積使肝臟結構發生可逆性改變。需要特別關注的是促炎性巨噬細胞的浸潤和極化以及促炎性細胞因子的產生可直接激活HSC，從而促進肝纖維化的發展。肝纖維化發生時KC細胞中T細胞免疫球蛋白域與粘蛋白域-4(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain-4，TIM-4)表達增多，對TIM-4的干擾抑制了蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)介導的活性氧的產生，導致PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)-Parkin、LC3-II/I的激活抑制和轉化生長因子β(Transforming growth factor β，TGF-β)的分泌減少[51]，通過介導Akt1/線粒體自噬信號通路，抑制TIM-4可對抗CCl4誘導的肝纖維化。近期研究[52]指出，抑制巨噬細胞中單酰甘油脂酶(monoacylglycerol lipase，MAGL)對肝纖維化的改善依賴于自噬。Atg5flox/flox;Lyz-Cre小鼠原代KC中IL-1α和IL-1β分泌增多，導致肝細胞凋亡增多[53]。肝細胞凋亡是慢性肝病的一個常見特征，它通過促進肝肌成纖維細胞存活和增強其成纖維原性來促進纖維化過程[54]。肝纖維化患者或肝硬化患者的肝單核細胞中LC-3相關的吞噬作用(LC3-associated phagocytosis，LAP)增強，對LAP進行抑制肝臟炎癥加重，肝纖維化惡化[55-56]。機制研究表明，LAP誘導的抗炎和抗纖維化信號通路是由于Fc免疫受體FCGR2A/FcγRIIA表達增強和FCGR2A介導的PTPN6/SHP-1抗炎通路的激活，導致LC3+吞噬小體對IgG的吞噬增加。然而有研究表明，對HSC自噬的抑制可以阻礙其激活，發揮抗肝纖維化的作用[57-58]。因此，由于自噬在肝纖維化中具有細胞特異性的作用，利用自噬途徑進行細胞特異性藥物遞送系統的設計，必定是將自噬作為抗纖維化治療的潛在靶點值得考慮的條件。

3.3 其他相關肝病 給予高脂飼料喂養的小鼠LPS刺激后，Atg5flox/flox;Lyz-Cre小鼠出現肝臟特異性炎癥，而沒有更嚴重的脂肪組織炎癥[59]，自噬缺失調節巨噬細胞向M1極化從而促進了肥胖相關的炎癥反應。在MCD(methionine-choline-deficient)飲食喂養構建的小鼠非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)模型中，巨噬細胞內缺氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor，HIF-1α)水平升高，HIF-1α介導了NF-κB的激活和CCL2的釋放，以及HIF-1α介導的巨噬細胞自噬受損增加了IL-1β的產生[60]。然而，自噬的激活需要NF-κB的參與[61]，HIF-1α介導的NASH是否為巨噬細胞自噬與NF-κB的共同作用還有待進一步研究。

癌癥的發病率和死亡率總體上在下降，但肝細胞癌的發病率和死亡率都在上升[62]。自噬缺失的KC在腫瘤形成前階段更易促進腫瘤發生，此過程是線粒體活性氧-NF-κB-IL-1α/β依賴性的[63]。TAM向M1型再極化具有免疫活性，有利于腫瘤消退。研究表明一種天然化合物黃芩苷通過促進TAM向M1再極化，促進促炎性細胞因子的釋放，抑制肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)發生發展，此過程自噬水平升高，介導了TNF受體相關因子2(TNF receptor-associated factor 2，TRAF2)的p62依賴性自噬降解，引起NF-κB2通路轉錄激活[64]。

4 總結與展望

肝臟是機體重要的代謝器官之一，機體80%～90%的固有巨噬細胞存在于肝臟[65]，其對免疫反應的正確調控具有關鍵作用，參與了肝臟各種生理病理過程。肝臟發生病變時，主要有兩種來源的巨噬細胞發揮作用，分別是來自于肝臟固有駐留巨噬細胞和外周血的單核細胞分化而來的巨噬細胞。巨噬細胞在肝病中既具有促進炎癥或加重損傷的作用，又具有抗炎或促進修復和促進纖維化的作用，其功能與巨噬細胞狀態直接相關，巨噬細胞的功能轉變受到多種刺激和周圍環境的調控。作為一種天然的細胞防御生理過程，自噬參與了先天免疫反應。大量研究揭示了自噬與巨噬細胞的功能調控具有密切聯系：從巨噬細胞分化到巨噬細胞誘導極化，再到細胞因子的釋放和炎癥反應，巨噬細胞幾乎所有的功能都與自噬相關。盡管對巨噬細胞自噬在肝病中的作用研究越來越多，但仍舊存在諸多尚未解決的問題，例如：不同肝病中，自噬調節巨噬細胞功能的具體作用機制；由于自噬在不同細胞中作用的差異，如何靶向特定細胞設計調控自噬的藥物；自噬如何調控巨噬細胞成熟分化的不同階段等，這些問題的提出與解決將為以巨噬細胞自噬為靶標預防和治療肝病提供全新的探究方向。