基于土大黃苷定性定量檢測的大黃類中藥摻偽鑒定方法研究進展

陳雪，辛杰,2，王振,2，張波,2

(1.臨沂大學(xué)藥學(xué)院，山東 臨沂 276005；2.山東省魯南中藥材工程技術(shù)研究中心，山東 臨沂 276005)

大黃為蓼科植物掌葉大黃(RheumpalmatumL.)、唐古特大黃(RheumtanguticumMaxim.ex Balf.)或藥用大黃(RheumofficinaleBaill.)的干燥根和根莖，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃等多種功效，屬于臨床常用中藥材之一[1]。由于大黃市場需求量及消耗量均較大，利益驅(qū)使下易出現(xiàn)人為摻偽現(xiàn)象，再者大黃為多基源植物藥，且正品大黃與同屬偽品大黃[如華北大黃(R.franzenbachiiMunt.]、河套大黃(R.hotaoenseC.Y.Cheng et Kao)、藏邊大黃(R.emodiiWall.)、疏枝大黃(R.spiciformeRoyle等)在性狀及顯微特征方面較難鑒別，也容易造成客觀上的誤用、錯用等現(xiàn)象發(fā)生[2]。因此，多種因素作用下導(dǎo)致市售大黃藥材或含大黃的中成藥中出現(xiàn)摻偽現(xiàn)象，如李敏等[3]對收集自25個廠家的3種大黃飲片共計60個批次樣品進行質(zhì)量考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生大黃、酒大黃和熟大黃飲片的摻假率分別為50%、47%和41%，質(zhì)量問題之大令人擔(dān)憂；又如樊寶娟等[4]對市售112批含大黃制劑中的大黃用料和15批大黃飲片真?zhèn)芜M行抽檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)112批制劑中32批大黃投料摻偽，且15批大黃飲片中9批為偽品；可見大黃摻偽現(xiàn)象十分嚴重。因此，加強大黃類藥材真?zhèn)舞b定方法研究，對保障大黃的用藥安全性和有效性具有重要意義。

目前，大黃真?zhèn)舞b定方法主要有性狀鑒定、顯微鑒定、理化鑒定和分子鑒定等多種方法，但性狀鑒定及顯微鑒定準確性偏低，而分子鑒定則技術(shù)要求和檢測成本偏高，比較而言，理化鑒定則兼顧準確性及可操作性強等優(yōu)點，在實際應(yīng)用中較為廣泛[2]。土大黃苷(rhaponticin，RHA)為二苯乙烯衍生物，主要存在于河套大黃、華北大黃、藏邊大黃、疏枝大黃等大黃屬植物中，自1990年版《中國藥典》首次明確指出RHA可作為真?zhèn)未簏S鑒定的指標性成分以來，基于RHA定性定量檢測的大黃真?zhèn)舞b定方法得到了廣泛應(yīng)用[5]。

大黃類藥材種類繁多，包括大黃生藥、炮制品(酒大黃、熟大黃、大黃炭)以及含大黃的中藥制劑，據(jù)統(tǒng)計《中國藥典》2015年版共收載含大黃的制劑153種，占制劑總數(shù)的10.2%，且制劑中大黃的比重差異顯著[6]。繁雜的藥物種類和眾多的劑量差異，給大黃藥材及制劑中大黃投料的真?zhèn)舞b定帶來了極大挑戰(zhàn)。如何利用RHA的特異性來實現(xiàn)大黃原料的有效鑒定？顯然，藥典提供的薄層色譜法(TLC)尚不能完全解決這個問題。因此，為充分發(fā)揮RHA在大黃類藥材真?zhèn)舞b定過程中的重要作用，本文分別對2000年1月-2020年1月發(fā)表的相關(guān)文獻進行檢索，對RHA在大黃類藥材真?zhèn)舞b定中的應(yīng)用做一綜述，以供參考。

1 TLC

TLC具有操作簡單、檢測快速、結(jié)果直觀、檢測成本低等優(yōu)點，在有對照品的情況下可實現(xiàn)目標物的定性檢測，在《中國藥典》的【檢查】項中應(yīng)用十分廣泛。對于大黃生藥及其飲片(包括炮制品)，《中國藥典》2015年版采用聚酰胺薄膜為固相載體，以甲苯-甲酸乙酯-丙酮-甲醇-甲酸(30∶5∶5∶20∶0.1)為展開劑，通過在365 nm紫外燈下檢識，以“在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，不得顯相同的亮藍色熒光斑點”作為判斷真?zhèn)未簏S的依據(jù)[1]。

而對于含大黃的中藥方劑，由于處方中其他藥材的化學(xué)成分可能與RHA存在干擾，導(dǎo)致上述檢測條件無法實現(xiàn)RHA的良好分離，因此對于方劑中RHA的TLC鑒定方法在固相載體和展開系統(tǒng)方面均有所變化。《中國藥典》2015年版僅明確了2個處方(九味肝泰膠囊和三黃片)中大黃類藥材要進行RHA定性檢測[1]，相對于共計153個含大黃的處方來說少之又少。鑒于此，本文收集整理了更多含大黃的制劑中RHA的TLC檢測方法(見表1)，以供法參考。

表1 TLC法檢測RHA在大黃類藥材及其制劑真?zhèn)舞b定中的應(yīng)用

由表1可知，在含大黃的中藥復(fù)方制劑TLC檢測RHA研究中，硅膠G板為固相載體應(yīng)用較廣，而與之對應(yīng)的展開系統(tǒng)以“三氯甲烷-甲醇-甲酸-水”為主；而以聚酰胺薄膜為固相載體的展開系統(tǒng)以“甲苯-甲酸乙酯-丙酮-甲醇-甲酸”為主。

2 高效液相色譜(HPLC)

TLC方法雖然簡便易行，但部分學(xué)者研究顯示TLC存在色譜圖清晰度不足，辨識困難等問題，且提出HPLC分離度更好、靈敏度更高，更適用于RHA的檢測，有利于大黃藥材的去偽存真[16]。近年來，多位學(xué)者基于HPLC技術(shù)開展了針對正品大黃、偽品大黃及含大黃的中藥制劑中RHA的定性定量檢測方法研究。由于通過RHA的有無即可定性判斷大黃類藥材的真?zhèn)危虼溯^多學(xué)者僅利用HPLC進行RHA的定性檢測，但也有學(xué)者通過定量檢測同時結(jié)合主成分分析法來判斷大黃類藥材的真?zhèn)蝃17]，詳細信息見表2。

表2 HPLC檢測RHA方法參數(shù)表

由于部分中成藥中大黃組分比例較小，導(dǎo)致即使投料為偽品的情況下直接采用HPLC仍無法檢測RHA是否存在。為解決這一問題，Chen等[31]以Fe3O4為磁組件，RHA為模板分子，丙烯酰胺為功能單體，苯乙烯為共聚單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，二甲亞楓為致孔劑，通過懸浮聚合法制備了磁性分子印跡聚合物，并將其用于富集中成藥提取液中的RHA，然后再利用HPLC進行定量檢測。該方法對RHA的最低檢測限達6.63 μg·L-1，檢測范圍為0.59～713.6 nmol·L-1，適用于闌尾消炎片、排毒養(yǎng)顏膠囊、大黃蟄蟲膠囊和三黃片等中成藥中RHA的檢測。

3 超高液相色譜(UPLC)

與HPLC相比，UPLC靈敏度和分離效率更高，檢測速度更快。任偉光等[32]以ACQUITY BEH C18色譜柱為分析柱，采用梯度洗脫的方式，建立了同時檢測大黃樣品中包括RHA在內(nèi)的8種化合物的UPLC檢測方法。該方法分析效率高，整個檢測時間在9 min內(nèi)完成，其中RHA的檢測范圍為2.02～129.44 μg·mL-1。

4 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)

LC-MS結(jié)合了色譜和質(zhì)譜的優(yōu)勢，通過LC實現(xiàn)化合物分離，然后通過MS的離子峰信息(包括一級、二級或多級質(zhì)譜離子峰)對待測樣品進行定性鑒別，其靈敏度和準確性更高。

孫愛萍等[33]采用LC-MS/MS技術(shù)建立了中成藥麻仁丸中偽品大黃RHA的定性檢測方法，其中HPLC條件為：資生堂C18色譜柱，流動相為0.01 mol·L-1醋酸銨-乙腈(40∶60)；MS采用ESI-離子源。測試結(jié)果顯示：RHA對照品保留時間為26 min，準分子離子[M-H]-峰為m/z 419，主要碎片離子m/z為257和241。通過與對照品離子峰對比檢測，受驗14批麻仁丸中有10批檢測到RHA，即說明投料摻有偽品大黃。

楊萍等[34]則以ESI+為離子源，建立了中成藥一清顆粒中RHA的定性檢測方法，結(jié)果顯示RHA的準分子離子峰[M+H]+m/z為421，二級質(zhì)譜離子掃描RHA碎片離子峰m/z包括259、227、199和135。

此外，LC-MS在RHA的藥代動力學(xué)研究中發(fā)揮重要作用。Zhao等[35]通過UHPLC-DAD-MSn技術(shù)確認了RHA([M+H]+m/z 421)的代謝產(chǎn)物為丹葉大黃素(RPG，[M+H]+m/z 259；二級m/z 241、226.9、199、149、135、107.1)；并基于UHPLC-Q-TOF/MS技術(shù)建立了RHA和RPG在大鼠血清中的檢測方法。

以上研究可知，LC-MS檢測RHA的定性主要依據(jù)離子峰信息為RHA的一級準分子離子峰和RPG相關(guān)的二級離子峰信息。

5 毛細管電泳法(CE)

尚小玉等[36]建立了快速分離大黃類藥材中大黃酚、大黃素、大黃酸和RHA等4種成分的膠束電動毛細管色譜法(MECC)，通過單因素實驗對條件進行優(yōu)化后(緩沖液為50 mmol·L-1H3BO3-NaOH含緩沖液為20 mmol·L-1SDC，pH 10，分析電壓17 kV)，可在5 min內(nèi)完成4種成分的全部分離。然后其通過環(huán)糊精修飾對MECC進行了進一步優(yōu)化，建立了基于環(huán)糊精修飾的混合MECC內(nèi)標定量法用于分離、測定大黃類藥材中的6種化學(xué)成分，在最優(yōu)條件下(緩沖液為20 mmol·L-1硼砂緩沖液含20 mmol·L-1SDC，20 mmol·L-1STC和15 mmol·L-1β-環(huán)糊精，pH 10.5～11.1，分析電壓17 kV)，RHA檢測范圍為5～80 μg·mL-1，整個分析時間在25 min以內(nèi)[37]。

Yang等[38]利用β-環(huán)糊精作為調(diào)節(jié)劑，建立了RHA、RPG及兩者異構(gòu)體分離檢測的毛細管區(qū)帶電泳法(CZE)，該方法可在3 min內(nèi)完成樣品分析，通過紫外可見分光光度法和核磁共振檢測分離后的樣品，證實該CZE準確高效。

6 化學(xué)發(fā)光測定法(CLA)

在硫酸酸性介質(zhì)條件下，高錳酸鉀可以直接氧化RHA而產(chǎn)生較強的化學(xué)發(fā)光，基于此，木合塔爾·吐爾洪等[39]結(jié)合流動注射技術(shù)，建立了一種快速準確和簡便的RHA含量測定方法，該CLA對RHA的檢測限和定量限分別為0.2 ng·mL-1和0.6 ng·mL-1。

7 結(jié)語

作為大黃類藥材的真?zhèn)舞b定特異性成分，RHA的主要定性定量檢測方法包括TLC、HPLC、UPLC、LC-MS、CE和CLA等，其中TLC對飲片類藥材及含大黃組分較多的中成藥的鑒定可以取得理想效果，且方法簡便快速；但對于大黃用量較低的中成藥的RHA檢測仍需借助HPLC、UPLC或LC-MS進一步驗證，或檢測前進行RHA的富集。此外，CE法在RHA的分離與檢測方面十分高效，具有較好的開發(fā)潛力。對于CLA法，其在中藥的復(fù)雜基質(zhì)中能否實現(xiàn)RHA的準確檢測還有待進一步研究。

中藥質(zhì)量好壞是保障臨床安全有效的關(guān)鍵，中藥鑒定的核心任務(wù)之一即是確保藥材的真實性，目前中藥鑒定已由傳統(tǒng)鑒定手段向現(xiàn)代鑒定技術(shù)發(fā)展，且發(fā)展十分迅速，然而基于化學(xué)成分鑒定仍是目前主流鑒定依據(jù)之一，而真?zhèn)舞b定特異性成分是眾多鑒定工作者苦苦尋覓的目標，但是可遇而不可求。但對于大黃這一臨床應(yīng)用廣泛且制劑豐富的具體藥物而言，RHA是藥典已確認的真?zhèn)舞b定指標化合物，因此，應(yīng)充分利用RHA的特異性深入開發(fā)大黃及含大黃的中藥制劑的真?zhèn)舞b定技術(shù)，進一步完善藥典標準。建議：①針對藥典中收載的所有含大黃的中藥制劑首先利用TLC法進行RHA檢測，建立TLC檢測標準；②對于TLC無法確認的，可進一步建立HPLC或LC-MS技術(shù)鑒定RHA；③開發(fā)靈敏度高、特異性強且操作簡便的RHA快速檢測技術(shù)(如基于免疫檢測原理的可視化試紙條技術(shù))，以達到廣泛適用和現(xiàn)場化鑒定的需求。