肝癌患者中RNF24的表達及臨床價值

伍雋華，陳云揚，張鑫，余杰雄，崔恩銘，張慧玲

肝細胞癌（HCC）是最常見的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤，全世界范圍內(nèi)常見的致死腫瘤之一［1］。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的檢查方法與篩查手段被挖掘。然而，肝癌的早期檢出率及患者的預(yù)后仍不盡如人意，有關(guān)研究、探索依然有很大的空間［2，3］。為進一步做好肝癌的早期篩查及精準防治工作，新型腫瘤標記物的發(fā)現(xiàn)至關(guān)重要。RNF24是一種定位于高爾基體膜中新型膜蛋白，該蛋白含有鋅指結(jié)構(gòu)，可與瞬時受體電位陽離子通道蛋白6（TRPC6）的錨蛋白樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域相互作用并影響TRPC細胞內(nèi)運輸［4］。我們前期生信篩查提示，較癌旁組織而言，RNF24在肝癌組織中呈高表達趨勢。當前，RNF24在腫瘤（包括肝癌）中作用罕有研究報道，RNF24在肝癌發(fā)生、發(fā)展中扮演什么角色仍不清楚。本研究擬借助大數(shù)據(jù)時代提供的機遇，利用公共數(shù)據(jù)資源、探討RNF24在肝癌中表達及其對肝癌患者預(yù)后的影響。同時，通過分析RNF24與腫瘤微環(huán)境中免疫細胞浸潤的關(guān)系，探究RNF24在肝癌中發(fā)揮作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

從Firebrowse網(wǎng)站下載具有完整臨床信息（包含生存信息）的肝癌患者RNA-seq數(shù)據(jù)205例，其中男性患者135例，女性患者70例。根據(jù)操作說明解碼數(shù)據(jù)，進行后續(xù)分析。

1.2 臨床指標選擇

結(jié)合數(shù)據(jù)庫提供臨床參數(shù)的實際情況，經(jīng)過專家篩選，本研究納入了患者性別、年齡、體重、白蛋白水平、甲胎蛋白（AFP）水平、血小板、凝血酶原時間、膽紅素、腫瘤分級、血管侵犯、腫瘤重量及腫瘤壞死百分比等臨床指標，進行患者預(yù)后分析。

1.3 RNF24 mRNA在肝癌中的表達

UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu）是一個在線工具，主要包含各種不同類型的腫瘤患者RNAseq數(shù)據(jù)［5］。本文利用此平臺分析RNF24基因表達水平及其與肝癌患者臨床特征之間的關(guān)系。

1.4 RNF24蛋白在肝癌中的表達

HPA數(shù)據(jù)庫（https：//www.proteinatlas.org）包含近20種不同腫瘤的基因表達信息［6］。本研究使用該工具評估正常組織和癌組織中RNF24蛋白質(zhì)表達水平。分析過程由兩人獨立進行，并通過Image J軟件進行定量分析。

1.5 RNF24與免疫細胞浸潤的相關(guān)性

TIMER數(shù) 據(jù) 庫（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）是腫瘤免疫研究經(jīng)典數(shù)據(jù)庫，用于分析各種癌癥中基因表達與免疫細胞浸潤之間的相關(guān)性［7］。本研究分析了肝癌患者RNF24表達與B淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞，巨噬細胞，中性粒細胞和樹突狀細胞浸潤之間的關(guān)系。同時，我們采用多變量Cox分析探討常見臨床指標、浸潤免疫細胞亞群及RNF24表達對患者預(yù)后的影響。

1.6 RNF24對肝癌患者預(yù)后的影響

Kaplan-Meier plotter（http：//kmplot.com/analysis/）平臺是一個經(jīng)典的生存分析工具［8］。本項研究分析了RNF24在364例肝癌癥患者的總生存期（OS）、無進展生存期（PFS）、無復(fù)發(fā)生存期（RFS）及疾病特異性生存期（DSS），預(yù)測RNF24在肝癌患者預(yù)后中的價值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗。采用多變量Cox分析探討RNF24、免疫浸潤及常見臨床指標對預(yù)后的影響；采用單變量/多變量Cox比例風險回歸模型確定RNF24表達與患者生存率的關(guān)系；采用Kaplan-Meier法評估RNF24對肝癌患者生存的影響。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNF24在肝癌中表達及與腫瘤分期、分級的關(guān)系

UALCAN數(shù)據(jù)庫檢測RNF24 mRNA在肝癌中表達量中位值（median，M）為0.712（q1=0.376，q3=1.287），明顯高于正常肝組織中位值0.265（q1=0.17，q3=0.371）（P＜0.01；圖1A）。進一步，我們分析RNF24表達水平與肝癌分級、臨床分期之間的關(guān)系，結(jié)果表明隨著腫瘤中RNF24表達水平的升高，患者臨床分期、腫瘤分級越差（圖1B、1C）。最后，我們利用HPA數(shù)據(jù)資源發(fā)現(xiàn)RNF24在肝癌組織中蛋白表達水平比對應(yīng)正常肝組織高（圖1D、1E、1F）。

2.2 RNF24在肝癌中表達與免疫細胞浸潤的關(guān)系

利用TIMER數(shù)據(jù)庫探究RNF24與免疫細胞浸潤之間的相關(guān)性，我們發(fā)現(xiàn)B淋巴細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞以及樹突狀細胞的浸潤水平與RNF24水平呈正相關(guān)（圖2A，所有P＜0.05）。進一步，使用多變量Cox分析來探究免疫細胞浸潤、常見臨床指標及RNF24表達水平對肝癌患者預(yù)后的影響。結(jié)果顯示，腫瘤分期、CD8+T細胞和樹突狀細胞浸潤以及RNF24表達都是影響肝癌預(yù)后的影響因素。并且，盡管RNF24表達對肝癌患者1年生存期無顯著影響，但RNF24是患者3年、5年生存期的危險因素（表1；圖2B、2C、2D）。

圖1 RNF24在肝癌中表達譜及與腫瘤臨床分期、分級的關(guān)系 圖A：RNF24在TCGA的表達情況（UALCAN）；圖B：RNF24表達與肝癌腫瘤分期的關(guān)系（UALCAN）；圖C：RNF24表達與肝癌腫瘤分級的關(guān)系（UALCAN）；圖D～F：RNF24在肝癌中的蛋白表達情況（HPA）

表1 336例肝癌患者免疫浸潤、RNF24表達及常見臨床指標對患者預(yù)后的Cox分析

2.3 RNF24對患者臨床預(yù)后的影響

通過Kaplan-Meier生存分析，我們發(fā)現(xiàn)RNF24表達水平越高的肝癌患者總體生存率越短（HR=2，95%CI：1.42～2.84；P=6.3e-5；圖3A）。進一步分析PFS，RFS和DSS時，我們發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果（圖3B、3C、3D），這些結(jié)果均表明RNF24高表達與肝癌患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)。

圖2 肝癌中RNF24表達與免疫浸潤的相關(guān)性 圖A：RNF24表達與免疫細胞浸潤之間的相關(guān)性；圖B～D：免疫浸潤、RNF24表達對肝癌患者1年、3年和5年生存期的影響

圖3 RNF24對患者生存的影響 圖A：總體生存期（OS）；圖B：無進展生存期（PFS）；圖C：無復(fù)發(fā)生存期（RFS）；圖D：疾病特異性生存期（DSS）

2.4 RNF24是肝癌患者預(yù)后的獨立危險因素

從Firebrowse網(wǎng)站下載RNF24表達和對應(yīng)患者臨床信息數(shù)據(jù)，經(jīng)過兩位專家獨立篩查，我們納入了具有完整信息的205例肝癌患者、12個常見臨床指標進行單因素與多因素Cox回歸分析。患者臨床信息見表2。單因素與多因素Cox回歸分析結(jié)果見表3，結(jié)果顯示在單因素分析中，總膽紅素（TB）水平（HR=21.354，95%CI：5.942～76.743，P＜0.001），腫瘤重量（HR=1.001，95%CI：1.000～1.001，P＜0.001）和RNF24表達水平（HR=1.003，95%CI：1.000～1.005，P=0.011）為患者總體存活率（OS）的危險因素；多因素分析結(jié)果提示，總膽紅素水平、腫瘤重量及RNF24表達水平與患者總體生存率顯著相關(guān)。

表3 205例肝癌患者Cox生存分析

3 討論

RNF（RINGFinger）蛋白是一類包含環(huán)指基序的鋅指蛋白，可以結(jié)合E3泛素化酶及其底物，起連接酶的作用，促進目標蛋白的降解［9］。研究表明，RNF在調(diào)節(jié)細胞分化，生長和轉(zhuǎn)化中起著重要作用，RNF的異常表達亦可導(dǎo)致某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［10］。RNF24作為家族中重要的一員，其在生命活動調(diào)節(jié)中所起的作用也備受關(guān)注。Lussier等［4］在研究中指出，RNF24與高爾基體中的TRPC相互作用并影響TRPC胞內(nèi)運輸，但不會影響其活性。然而，RNF24在肝癌中的作用沒有報道，其內(nèi)在機制仍有待探究。

本研究利用信息時代提供的契機，通過挖掘數(shù)據(jù)庫中RNF24基因在肝癌中的表達及作用的有關(guān)信息，充分利用數(shù)據(jù)資源。我們的研究結(jié)果表明，無論從mRNA水平還是蛋白質(zhì)水平，RNF24基因在肝癌組織中的表達顯著高于在正常肝組織中的表達。同時，臨床資料分析結(jié)果提示高表達的RNF24與肝癌患者臨床分期、腫瘤分級顯著相關(guān)，這也提示了RNF24在肝癌患者中可能作為一種預(yù)后不良預(yù)測因子。進一步，我們檢測了RNF24水平與免疫浸潤細胞的相關(guān)性，腫瘤微環(huán)境中免疫細胞浸潤已被證明是多種癌癥的預(yù)后影響因素［11，12］。本研究顯示RNF24水平與某些免疫細胞浸潤相關(guān)，但腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞如何影響RNF24的表達，促進肝癌的生長、進展，尚需進一步研究。最后，本研究利用Kaplan-Meier生存數(shù)據(jù)庫分析，結(jié)果提示RNF24高表達的肝癌患者生存期更短。單因素及多因素Cox回歸分析表明RNF24高表達是肝癌患者預(yù)后的獨立危險因素。

綜上，RNF24基因可能通過影響腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞的組成及比例影響肝癌患者的預(yù)后。RNF24在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色，有望成為肝癌患者預(yù)后預(yù)測的一種新型標記物。深入研究其發(fā)揮作用的內(nèi)在機理，未來可為肝癌的精準防治提供新的思路。