氟哌啶醇對血清剝奪PC12細胞的保護作用及機制研究*

白淵翰 楊 曦 曾志文

目前，第一代抗精神病藥物(First Generation Antipsychotics, FGAs)由于其嚴重的椎體外系和心血管系統不良反應，逐漸退居為二線的治療方案。有趣的是，作為FGAs代表的氟哌啶醇，仍舊活躍在精神分裂癥和雙相障礙的治療當中[1, 2]。除了確證的臨床療效外，多項基礎研究提示了氟哌啶醇對細胞損傷的保護性作用[3～5]。蛋白激酶B(Protein Kinase B，PKB/Akt)是促進神經發育及細胞存活的一種重要激酶，其編碼基因AKT也是精神分裂癥的易感基因，Akt激酶在精神分裂癥的發病和藥物治療中均發揮了重要作用[6, 7]。前期研究發現氟哌啶醇在體內可以增加Akt激酶活性[7]，而氟哌啶醇是否通過激活Akt激酶并促進細胞存活并不清楚。叉頭型轉錄因子O亞型(Forkhead Box Os，FoxOs)家族中的FoxO1和FoxO3a是Akt激酶的下游靶標，同時也受磷酸肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-Kinase，PI3K)的調控。FoxOs作為誘導細胞損傷的關鍵分子[8]，其在氟哌啶醇細胞保護中的作用也不明確。

PC12細胞來源于成年大白鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤的細胞系，目前作為細胞模型被廣泛用于神經細胞存活和凋亡的研究中[9]。研究已證明，當去除培養基中血清時，PC12細胞表現出時間依賴性的凋亡，并且表現出明顯的DNA片段破碎的凋亡模式[10]。本研究擬觀察氟哌啶醇對血清剝奪PC12細胞的保護性作用，同時采用不同濃度或不同作用時間的氟哌啶醇及特異性的PI3K/Akt信號通路抑制劑預處理研究其在Akt/PI3K-FoxOs信號轉導通路中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和實驗設備 細胞：PC12細胞由加拿大Mcgill University道格拉斯研究中心Remi Quirion教授饋贈提供。試劑：DMEM、胎牛血清(FBS)、馬血清(HS)、二聯抗生素(PSA)均購自美國GIBCO 公司。氟哌啶醇，LY294002、AktVIII，U0126 均購自美國Sellect公司。設備：雙人單面凈化超凈臺(蘇州凈化設備有限公司)，賽默飛二氧化碳培養箱(美國Thermo公司)，蔡氏倒置熒光顯微鏡，BioTek Synergy H1多功能酶標儀。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 PC12細胞培養于含有5%FBS、5%HS、1%PSA的DMEM培養基中，于37 ℃、5%CO2條件下培養，待細胞長滿后，用含l%FBS、1%PSA的DMEM培養基接種于96孔和6孔板，16 h后對細胞進行處理。

1.2.2 細胞活力測試 血清剝奪實驗：將96孔板培養液換成無血清DMEM，孵育1 h后進行處理。7組細胞分別給予含1%FBS的DMEM和不同劑量(0 μm、0.1 μm、0.3 μm、1 μm、3 μm、10 μm)的氟哌啶醇。抑制劑預處理實驗：血清剝奪PC12細胞分為6組，其中3組分別給予不處理，1%FBS，1 μm的氟哌啶醇，另外3組分別給予10 μm的LY294002、5 μm的AktVIII、5 μm的U0126處理30 min后，加入濃度為1 μm的氟哌啶醇。MTT法檢測細胞活力：上述兩個實驗中每組細胞設6個復孔，于培養箱中培養24 h后，每孔加入10 μm MTT(10 mg/ml)，再培養3 h，吸去培養液，加DMSO 200 μl/孔，待甲躦結晶完全溶解后，用酶聯免疫儀在波長570 nm處讀取每孔吸光度(A)。取6孔A值的均數按公式計算細胞存活率=(試驗孔A均值/對照孔A均值)× 100%，重復3次。

1.2.3 蛋白提取與Western blot檢測 PC12細胞傳代并接種于6孔板，于細胞培養箱中培養16 h后，剝奪血清1 h，隨后6組細胞加入不同劑量(0 μm、0.1 μm、0.3 μm、1 μm、3 μm、10 μm)的氟哌啶醇處理，30 min后收獲蛋白。將同樣處理的另外6組血清剝奪PC12細胞中加入1 μm氟哌啶醇，處理不同時間(0 min、8 min、15 min、30 min、60 min、120 min)后收獲蛋白。另分5組同樣處理的血清剝奪PC12細胞分別給予不處理、氟哌啶醇1 μm、10 μm的LY294002、5 μm的AktVIII、5 μm的U0126。加入抑制劑30 min后3組細胞均接受氟哌啶醇1 μm處理，30 min后收取蛋白。上述三個實驗中每組細胞設6個復孔。Western blot實驗：向不同實驗因素處理的細胞中加入2×Sample Buffer，在冰上搖震裂解細胞約30 min，吸出裂解液，沸水加熱8 min使蛋白充分變性，離心冷卻后可進行Western免疫印跡。采用SDS-PAGE電泳，每孔加50 μg蛋白樣品，90 V電泳分離蛋白，溴酚藍電泳至分離膠底部時取出分離膠，將其與PVDF膜相貼并排除氣泡，兩側夾以濾紙和海綿墊，插入電轉槽中60 mA過夜。取出PVDF膜，TBST洗滌，置入含5%脫脂牛奶的TBST中，室溫封閉90 min從牛奶中取出，TBST洗膜5 min×3次，加入適當比例稀釋的第1抗體4 ℃孵育過夜，次日取出，TBST洗膜5 min×3次，含5%脫脂牛奶的TBST稀釋二抗，室溫孵育1.5 h，TBST洗膜5 min×3次；配制發光液，在暗房內將發光液均勻滴加到膜上，靜置約2 min，出現熒光，根據熒光強度在壓片夾中曝光1～30 min不等，顯影、定影沖洗出膠片，目的蛋白顯示為黑色條帶；采用600 dpi分辨率掃描膠片，保存圖像數據。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行分析。采用單因素方差分析(ANOVA)分析組間差異，若差異有統計學意義時，進一步組間比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α= 0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 氟哌啶醇對血清剝奪PC12細胞存活率影響 與0 μm氟哌啶醇組相比，0.3 μm、1 μm、和3 μm氟哌啶醇能提升細胞存活率(P<0.05)。見圖1。與1%FBS組相比，不處理組PC12細胞存活率下降(P<0.05)。與不處理組相比，1 μm的氟哌啶醇能提升細胞存活率(P<0.05)。與1 μm的氟哌啶醇組相比，10 μm的LY294002和5 μm的AktVIII預處理能抑制氟哌啶醇對細胞存活率的提升(P<0.05)。見圖2。

注：與0 μm氟哌啶醇組比較，*P<0.05

注：與1%FBS組比較，*P<0.05；與不處理組比較，△P<0.05；與1%FBS組和1 μm的氟哌啶醇組比較，#P<0.05；-代表不予相應處理，+代表給予相應處理

2.2 氟哌啶醇不同濃度和不同作用時間對Akt、FoxOs、ERK蛋白磷酸化水平影響 不同濃度氟哌啶醇作用30 min后，與0 μm氟哌啶醇組相比，0.3 μm和1 μm氟哌啶醇能增加Akt、FoxO1、FoxO3a、ERK蛋白磷酸化水平(P<0.05)；3 μm氟哌啶醇能增加FoxO1、FoxO3a、ERK蛋白磷酸化水平(P<0.05)；10 μm氟哌啶醇能增加ERK蛋白磷酸化水平(P<0.05)。見圖3。氟哌啶醇作用15 min和30 min能增加Akt、FoxO1、FoxO3a、ERK蛋白磷酸化水平(P<0.05)；氟哌啶醇作用8 min能增加Akt和ERK蛋白磷酸化水平(P<0.05)；氟哌啶醇作用60 min后能增加FoxO1、FoxO3a蛋白磷酸化水平(P<0.05)。見圖4。

注：與0 μm氟哌啶醇組比較，*P<0.05

注：與0 min氟哌啶醇組比較，*P<0.05

2.3 PI3K、Akt、Mek抑制劑對Akt、FoxOs、ERK蛋白磷酸化水平影響 與不處理組相比，1 μm氟哌啶醇能增加Akt、FoxO1、FoxO3a、ERK蛋白磷酸化水平(P<0.05)。與氟哌啶醇組比較，LY294002和AktVIII能減少Akt、FoxO1、FoxO3a蛋白磷酸化水平(P<0.05)。見圖5。

注：與不處理組比較，*P<0.05；與氟哌啶醇組比較，△P<0.05;-代表不予相應處理，+代表給予相應處理

3 討論

本研究采用血清剝奪PC12細胞作為研究神經損傷和保護的細胞模型。血清剝奪可以降低細胞的存活率，氟哌啶醇可以增加血清剝奪PC12細胞的存活率。PI3K/Akt信號通路阻斷劑可以阻斷氟哌啶醇的保護作用，而Mek通路抑制劑無此作用，這說明氟哌啶醇的保護作用可能是通過PI3K/Akt通路介導的。接著發現氟哌啶醇可增加Akt、FoxO轉錄因子和ERK激酶的磷酸化水平，這一作用在氟哌啶醇為1 μm和30 min的作用時最為明顯，提示中等濃度的氟哌啶醇可能具有較好的神經保護作用，而這種神經保護作用會在一定范圍內隨時間延長而增加。本研究更進一步發現氟哌啶醇誘導的FoxO轉錄因子的磷酸化是通過PI3K/Akt激酶介導的。提示氟哌啶醇可以通過磷酸化激活PI3K/Akt通路抑制凋亡因子FoxOs轉錄因子而產生神經保護作用。

越來越多的研究證據顯示，抗精神病藥物的治療作用與Akt激酶相關的細胞內信號相關。小鼠模型經短期和長期氟哌啶醇處理后，腦內Akt1的磷酸化水平明顯升高[7, 11]。Beaulieu JM等[12～14]系統地證明了多巴胺D2受體通過beta-arrestin-2調節了Akt的磷酸化。這些結果表明，氟哌啶醇的作用機制可能是由Akt信號通路介導的。同樣，精神分裂癥患者接受氟哌啶醇治療后，額葉皮層內源性Akt1激酶的水平有所恢復[11]。

本研究發現氟哌啶醇在0.3～3 μm時具有較好的促細胞存活作用，而10 μm或者更高濃度時能產生細胞毒性和增加細胞的凋亡。先前研究也發現10 μm氟哌啶醇導致培養的大鼠皮層神經元磷酸化Akt顯著下降[15]，可以抑制PC12細胞的Akt的磷酸化水平[16]。這兩項研究提示，氟哌啶醇對Akt的磷酸化水平的影響在體外培養的神經細胞或相關細胞類型與體內完整的大腦反應似乎不同。培養細胞可能對藥物濃度比活體大腦依賴性更敏感-具有明顯的濃度依賴性[17]。與這些差異類似，其他研究也證明了體外培養的細胞激活D2受體，如quinpirole或溴隱亭激動劑也可能導致Akt的磷酸化，這表明體外多巴胺介導的Akt磷酸化的確切機制是復雜的[18, 19]，值得進一步研究探討。

FoxO蛋白家族在細胞發育、增殖、存活和代謝等生命過程中發揮著重要的作用，也是藥物研究的一個重要靶點[20]。大量的研究表明，作為PI3K/Akt信號通路的關鍵下游靶標，FoxO在PI3K/Akt信號通路調控細胞存活的過程中扮演著關鍵的角色，而且其轉錄活性直接受PI3K/Akt信號通路的調控[21]。本研究及其他課題組的研究均發現FoxO轉錄因子在血清剝奪模型和其他多種細胞毒性模型中激活，而鋰鹽、氯氮平及其他多種神經營養因子均可以抑制FoxO轉錄因子而產生神經保護作用[9, 22]。本研究發現氟哌啶醇可以增加FoxO1與FoxO3a轉錄因子的磷酸化，這在很大程度上可以解釋氟哌啶醇的神經保護作用機制，而這一作用機制與PI3K/Akt-FoxOs通路而非Mek-ERK通路相關。

綜上，血清剝奪誘導PC12細胞損傷是一個經典的神經保護藥理學研究細胞模型。本研究發現氟哌啶醇可以通過PI3k/Akt-FoxOs信號通路對PC12細胞產生神經保護作用，而這種作用表現出一定的量效和時效關系。后續研究可以關注氟哌啶醇在模型動物體內是否可以同樣影響PI3k/Akt-FoxOs信號通路，進一步探討該通路與其抗精神病的藥理機制之間的關系。