香蕉枯萎病拮抗放線菌的分離鑒定及抑菌機理分析

張惠茜，王 尉，周登博，云天艷，陳宇豐，謝江輝

(1 海南大學園藝學院，海口，570228；2 中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所，海口，571101)

香蕉(Musaspp.)屬于芭蕉科(Musaceae)、芭蕉屬(Musa)單子葉植物，是重要的果糧兼用作物。我國是世界香蕉第一大消費國和第二大生產國，主要栽培香蕉品系為“香芽蕉”(Cavendish，AAA)[1]。香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴專化型Fusariumoxysporumf. sp.cubense(簡稱Foc)，引起的維管束病害，為害我國香蕉種植區(qū)的主要為4號生理小種(Foc 4)，該小種侵染幾乎所有香蕉品種[2]。目前，尚未培育出農藝性狀較好的抗病品種，對于香蕉枯萎病的控制仍以傳統(tǒng)化學農藥為主，而此方法不僅污染環(huán)境，還會誘發(fā)病原菌產生抗藥性[3]。利用生防菌進行微生物防治，不僅能克服化學防治帶來的副作用，還能維持土壤菌群平衡。

當前，用于防治香蕉枯萎病的生防菌有芽孢桿菌、木霉和放線菌三大類。楊迪等從廣西蕉園土壤中分離出1株貝萊斯芽孢桿菌Blz02，對香蕉枯萎病的盆栽防效達到63.33%[4]。郭立佳等從香蕉根系土壤中分離出1株芽孢桿菌JK05，對香蕉枯萎病的盆栽防效達到了70.5%[5]。覃柳燕等從香蕉根系土壤中分離得到1株棘孢木霉PZ6，對香蕉枯萎病的盆栽防效為48.28%[6-7]。Jing等從健康的香蕉園中分離出1株放線菌JBS5-6，對香蕉枯萎病的防效達到64.94%[8]。盡管發(fā)現(xiàn)了一些具有作用的拮抗菌，但是不同生防菌的生長狀態(tài)及大田應用效果仍有待評價，因此，分離和鑒定高效拮抗菌仍是未來生防的重要課題。

本研究以Foc 4為靶標菌，從尖峰嶺國家森林公園潤楠根系土壤中分離得到1株具有良好拮抗作用的鏈霉菌JRGG-11；通過表型分析和16S rRNA聚類分析對JRGG-11的種屬進行鑒定；盆栽試驗進一步明確該菌防效，并對其抑菌機理進行了分析，研究結果有利于豐富香蕉枯萎病菌拮抗微生物資源庫，開發(fā)生物菌肥。

1 材料與方法

1.1 材料

拮抗菌株分離材料：海南省尖峰嶺國家森林公園1株潤楠Machiluspingii的根際土壤。

供試培養(yǎng)基：腐殖酸—維生素瓊脂培養(yǎng)基(HV)、葡萄糖—天冬氨酸培養(yǎng)基(GA)、淀粉—酪蛋白培養(yǎng)基(SIM)、淀粉酪素瓊脂培養(yǎng)基(SCA)、酵母膏麥芽膏培養(yǎng)基(YE/ISP2)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)、黃豆粉發(fā)酵培養(yǎng)基(SLM)。

供試病原菌：香蕉枯萎病菌4號生理小種(Foc 4)保存于中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所/海南省熱帶微生物資源重點實驗室。

植物材料：6～7葉巴西蕉(Musaspp.，AAA)杯苗，種植用土取自海南省儋州市健康香蕉園。

1.2 拮抗放線菌的分離篩選

土樣自然風干，充分研磨后過60目篩，稱取樣品5 g，溶于45 mL無菌水，55 ℃加熱20 min，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)1 h。用無菌水稀釋為終濃度10-1、10-2、10-3的土壤懸浮液，分別吸取稀釋液0.15 mL涂布于分離培養(yǎng)基(HV、GA、SIM、SCA)上，28 ℃培養(yǎng)7 d，取不同單菌落于YE培養(yǎng)基上純化[9]。

拮抗菌株初篩：采用平板對峙培養(yǎng)法[10]篩選Foc 4拮抗放線菌，十字交叉法測量菌落直徑，計算抑菌率。抑菌率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-5) ×100，菌落直徑單位為mm。

拮抗菌株復篩：將純化后的放線菌接種到SLM中，28 ℃、180 r/min搖床上培養(yǎng)7 d，得到發(fā)酵液，加入與發(fā)酵液等量的95%乙醇萃取2 d，過濾菌體，得到發(fā)酵液萃取液，旋轉蒸發(fā)儀蒸干，無菌水稀釋至終濃度20 mg/mL。用瓊脂孔洞擴散法[11]測定放線菌發(fā)酵液對Foc 4抑菌活性，十字交叉法測定抑菌率。

1.3 拮抗放線菌的分類鑒定

參考徐麗華等方法進行生理生化鑒定[12]。取YE培養(yǎng)基上生長良好的菌落，參照張文娟[13]的方法進行掃描電鏡樣品處理，通過掃描電鏡觀察放線菌菌絲和孢子的形態(tài)。采用北京BioTeke生物技術有限公司的細菌基因組DNA快速提取試劑盒分離總DNA。細菌鑒定通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT- 3′)用于PCR擴增，PCR產物送至上海生工生物公司測序。GenBank和EzBioCloud數據庫用于同源性比對，使用MEGA 7.0中的Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 盆栽試驗

將帶有GFP熒光的Foc 4孢子液接種至PDB培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min搖菌3 d，用4層紗布過濾得到孢子懸浮液，于10 000 r/min室溫離心，無菌水洗去培養(yǎng)基，制備成106CFU/mL病原菌孢子懸浮液。設置3個處理：即Foc 4處理，F(xiàn)oc 4孢子懸浮液浸泡香蕉苗30 min后定植于盆內，每7 d澆Foc 4孢子液100 mL和SLM培養(yǎng)基100 mL，連澆3周。Foc 4+JRGG-11處理，F(xiàn)oc 4孢子懸浮液浸泡香蕉苗30 min后定植于盆內，每7 d澆Foc 4孢子液100 mL和濃度為108CFU/mL的JRGG-11發(fā)酵液(由SLM培養(yǎng)基發(fā)酵)100 mL，連澆3周。對照，每7 d給香蕉苗澆SLM培養(yǎng)液100 mL。每處理香蕉苗30株，于28 ℃、70%相對濕度和12 h光照+12 h黑暗下培養(yǎng)。接種7 d和14 d后分別選取3個處理香蕉苗根系，用激光共聚焦顯微鏡觀察Foc 4孢子侵染情況。發(fā)病率和病情指數參照周登博等[14]方法計算。

1.5 抑菌機理

依據1.2的方法獲取的拮抗放線菌發(fā)酵液萃取液，在旋轉蒸發(fā)儀上濃縮至200 mL，利用色譜柱層析法將濃縮后的萃取液用50%、60%、70%、100%甲醇進行洗脫并蒸干，獲得活性物質提取物。用50%甲醇溶解提取物至20 mg/mL作為母液，保存于4 ℃冰箱。配制成含藥平板測定不同濃度甲醇洗脫的提取物活性。利用最小二乘法建立線性回歸[15]，根據毒力回歸方程計算EC50和EC95值。孢子萌發(fā)測定依據Wei等[16]的方法進行。

通過掃描電子顯微鏡(model S-4800，Hitachi Limited，Japan)觀察4×EC50處理下Foc 4菌絲形態(tài)，通過透射電子顯微鏡(JEM-1400 Flash，Hitachi Limited，Japan)觀察4×EC50處理下Foc 4細胞超微結構。

2 結果與分析

2.1 Foc 4拮抗放線菌的分離篩選

將根際土壤在4種分離培養(yǎng)基上稀釋涂布，共分離得到放線菌61株，以Foc 4靶標進行初篩，得到對Foc 4菌絲生長具有抑菌作用的放線菌17株，其中編號為JRGG-11的放線菌抑菌效果最好，初篩對Foc 4的抑菌率為(80.48±1.49)%，發(fā)酵液復篩對Foc 4抑菌率為(58.77±1.31)%(見圖1)。

圖1 放線菌JRGG-11對香蕉枯萎病菌的抑菌活性

2.2 放線菌JRGG-11的分類鑒定

2.2.1 放線菌JRGG-11生理生化鑒定 通過碳、氮源測試發(fā)現(xiàn)，菌株JRGG-11對鼠李糖、阿拉伯糖、棉子糖、D-纖維二糖、D-木糖、木聚糖、海藻糖、松三糖等8種碳源有偏好性，能夠較好地利用組氨酸、天門冬酰胺、L-羥基脯氨酸、硝酸鉀、蛋白胨、朊蛋白胨、酵母膏、酪蛋白等8種氮源。酶學測試發(fā)現(xiàn)菌株JRGG-11過氧化氫酶、硝酸還原、明膠液化、淀粉水解、纖維素水解、色氨酸、脲酶、脂酶等測試均為陽性，最適pH值7，對NaCl的耐受性小于7%(見表1)。

表1 放線菌JRGG-11的生理生化特性

2.2.2 放線菌JRGG-11分子生物學鑒定和掃描電鏡 菌株JRGG-11在掃描電鏡下的形態(tài)見圖2，可以看出孢子呈球形，表面有類似毛發(fā)的刺狀凸起。系統(tǒng)發(fā)育樹表明，菌株JRGG-11與菌株StreptomycesalbospinusNBRC 13846聚為一支，但置信度較低，無法確定具體種，結合生理生化特性，將菌株JRGG-11歸為鏈霉菌屬，在NCBI上登錄號為MW110901(見圖2)。

圖2 放線菌JRGG-11的鑒定

2.3 菌株JRGG-11發(fā)酵液的盆栽防效

從圖3香蕉根系切片可以看出，在病原菌處理7 d后，F(xiàn)oc 4處理的香蕉苗根表皮細胞富集了大量Foc 4孢子，14 d時中部導管有大量孢子附著。Foc 4和JRGG-11發(fā)酵液處理的香蕉苗根表皮只有少量Foc 4孢子分布。當Foc 4處理出現(xiàn)明顯的枯萎病癥狀時，其香蕉苗葉片大量枯黃，病情指數達到67.62；Foc 4+JRGG-11處理香蕉苗僅有少量枯黃葉片，病情指數為11.43。菌株JRGG-11對Foc 4防控效果達到83.10%。

注：左圖為不同處理香蕉幼苗根系中GFP-Foc 4定殖情況，右圖為不同處理香蕉幼苗病變癥狀。

2.4 菌株JRGG-11提取物的抑菌機理

2.4.1 JRGG-11提取物的活性測定 從圖4可以看出，用不同濃度的甲醇對菌株JRGG-11發(fā)酵液的活性成分進行提取，對比提取物的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)100%甲醇洗脫得到的提取物活性最好，對Foc 4的抑制率達到(99.25±0.19)%。對100%甲醇洗脫的提取物進行毒力回歸方程測定，得到回歸方程為Y=3.206 6+1.410 1X(R=0.99)，EC50為18.70 μg/mL，EC95為274.43 μg/mL。

注：a.不同濃度甲醇洗脫得到的JRGG-11提取物的抑菌活性，b.不同濃度JRGG-11提取物對Foc 4菌絲生長的影響。不同小寫字母表示在p<0.05水平上的差異顯著性。

2.4.2 JRGG-11提取物處理對Foc 4孢子萌發(fā)的影響 從圖5和表2 Foc 4孢子萌發(fā)情況可以看出，在JRGG-11提取物處理下，F(xiàn)oc 4孢子萌發(fā)受到抑制。2×EC50時，僅有少量孢子萌發(fā)，在4×EC50時，F(xiàn)oc 4孢子萌發(fā)完全被抑制。CK和1×EC50、2×EC50處理下，孢子萌發(fā)率之間存在顯著性差異，2×EC50處理的Foc 4孢子萌發(fā)率僅為CK的1/3。相比CK，1×EC50和2×EC50處理下的Foc 4孢子芽管長度分別縮短了40.18%和63.61%。

注：a—e分別為提取物0(無菌水，CK)、1×EC50、2×EC50、4×EC50、8×EC50 mg/L處理。

表2 放線菌JRGG-11不同濃度提取物對Foc 4孢子的影響

2.4.3 JRGG-11提取物對Foc 4菌絲形態(tài)特征的影響 從圖6a和圖6b可以看出，正常的Foc 4菌絲表面光滑，粗細均一，菌絲分布較為整齊。而從圖6c至圖6g可以看出，4×EC50濃度JRGG-11提取物處理后，F(xiàn)oc 4菌絲出現(xiàn)大面積膨大、破裂和皺縮現(xiàn)象，菌絲分布雜亂，頂端明顯的膨大、斷裂和皺縮。

2.4.4 JRGG-11提取物處理對Foc 4菌絲細胞超微結構的影響 從圖7可以看出，透射電鏡檢測Foc 4菌絲超微結構，未經JRGG-11提取物處理的Foc 4病原菌細胞，其細胞壁光滑完整，厚薄均一，細胞器清晰可見。經過4×EC50濃度JRGG-11提取物處理后，病原菌的細胞壁明顯增厚，細胞器模糊，細胞內出現(xiàn)大囊泡；細胞質和囊泡內基質明顯流失和濃縮，出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象；之后細胞壁開始溶解，細胞內細胞器溶解；細胞空腔化現(xiàn)象明顯，細胞質和細胞壁分離。

3 結論與討論

尖峰嶺是位于海南的熱帶原始森林，獨特的氣候孕育了豐富的微生物資源，筆者從尖峰嶺潤楠根際土壤分離出的Foc 4拮抗放線菌JRGG-11歸為鏈霉菌屬，該屬是主要的抗生素生產菌，也是在農業(yè)上運用較多的一類生防菌。其抑菌作用機制主要有4種：生態(tài)位競爭、抗生作用、重寄生作用和誘導系統(tǒng)抗性。抗生作用為最直接的抑菌方式，主要通過產生多肽類、聚酮類、核苷類或者水解酶等次級代謝物來抑制甚至殺死病原菌。

注：a和b為對照，c為4×EC50濃度JRGG-11提取物處理3 d的Foc 4菌絲形態(tài)；f和g分別為放大的d和e。a、c放大500×；b、f、g放大3 000×。

注：a為無菌水處理，b—f為4× EC50濃度JRGG-11提取物處理。

Jeong等從鏈霉菌CA5中提取出1種多烯大環(huán)內酯類物質CA5A，對葡萄灰霉病菌有良好的抑制作用[17]；覃可等發(fā)現(xiàn)鏈霉菌FT05W中含有幾丁質酶，抑制煙草黑脛病菌生長[18]。劉亞南等發(fā)現(xiàn)玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63活性代謝產物roflamycoin能夠顯著抑制4種病原菌生長[19]。本研究中，鏈霉菌JRGG-11提取物處理后的Foc 4菌絲發(fā)生斷裂、膨脹，可以看出其活性物質直接作用于菌體，通過抗生作用殺死菌絲。Feng等報道的CPT-11對杧果炭疽病的作用[20]以及王志芳等報道的Streptomycesalboflavus對串珠鐮刀菌的作用[21]也有類似結果出現(xiàn)。

盆栽試驗顯示，菌株JRGG-11的發(fā)酵液對Foc 4的防控效果達到了83.10%，優(yōu)于賴寶春等[22]從辣椒根系土壤中分離出的Foc 4拮抗菌灰銹赤鏈霉菌FX81(對香蕉枯萎病盆栽防效81.05%)，及周維等[23]從健康的香蕉植株根部分離出的解淀粉枯草芽孢桿菌G9R-3(對Foc 4盆栽防效65.00%)，但和葉乃瑋等用3株木霉制成的復合菌肥(對Foc 4防效89.73%)[24]相比效果稍差。大田不同于盆栽試驗，其生產環(huán)境多變且情況復雜，用單菌作為生防制劑或者菌肥往往效果欠佳，而通過不同功效的菌株組合制成多功能復合菌制劑可以達到更好效果，后續(xù)研究將探索JRGG-11復合菌制劑的生產。