3種中國原產(chǎn)雄性柿種質(zhì)花粉離體萌發(fā)條件優(yōu)化及其活力快速檢測

詹術森，陳思旭，郭大勇，張青林，羅正榮，徐莉清

(華中農(nóng)業(yè)大學園藝植物生物學教育部重點實驗室，武漢，430070)

柿(DiospyroskakiThunb.)為原產(chǎn)我國的柿科(Ebenaceae)柿屬(DiospyrosL.)植物，有2 000年以上的栽培歷史。根據(jù)果實能否自然脫澀及其性狀遺傳特點，可將現(xiàn)有柿品種分為兩大類：完全甜柿(Pollination-constant and non-astringent，PCNA)和非完全甜柿(non-PCNA)[1]。完全甜柿可在樹上自然脫澀，貨架期更長，是目前柿產(chǎn)業(yè)發(fā)展和遺傳改良的重點目標。選育具有自主知識產(chǎn)權的完全甜柿新品種是我國柿產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的“瓶頸”問題。柿品種改良以有性雜交為主，但長期的自然和人工選擇，現(xiàn)存種質(zhì)中以僅開雌花和單性結(jié)實的品種較多。由于父本的缺乏，甜柿遺傳改良不僅盲目性大，且已經(jīng)面臨近交退化的困境[2]。20世紀90年代本課題組在鄂、豫、皖三省交界的大別山區(qū)收集到一系列柿屬完全雄性種質(zhì)，后續(xù)研究證明其具有花粉量大、與其他柿品種親和性好等特性，是潛在的育種材料[3-6]；“鄂柿1號”是繼“羅田甜柿”后在大別山區(qū)發(fā)現(xiàn)的第二個中國甜柿新類型，其果實大、種子少，外觀和食用品質(zhì)優(yōu)良[7]，最近發(fā)現(xiàn)其可偶開雄花[8]。此外，我們的研究還證明，上述3種雄性種質(zhì)攜帶中國甜柿自然脫澀的顯性基因，說明其具有作為雜交父本應用于甜柿遺傳改良的潛力[9]。

龔榜初等發(fā)現(xiàn)，日本原產(chǎn)不完全甜柿(D.kakiThunb.)、油柿(D.oleiferaCheng)、君遷子(D.lotusL.)花粉萌發(fā)率高于40%，日本甜柿花粉萌發(fā)率低[10]。劉勇等發(fā)現(xiàn)日本甜柿花粉在25 ℃左右、蔗糖100～150 g/L、瓊脂2～3 g/L、pH值為5～6的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)2～13 h花粉萌發(fā)率最高[11]。周瑞金等[12]發(fā)現(xiàn)“禪寺丸”花粉在附加10%蔗糖、硼酸50 mg/L的培養(yǎng)基，25 ℃條件下花粉萌發(fā)率達到最大值69.53%。但中國原產(chǎn)雄性柿種質(zhì)花粉活力研究尚無詳細報道。本研究以兩個中國特有的僅著生雄花但帶有中國甜柿自然脫澀顯性基因的完全雄性種質(zhì)“雄株3號”“雄株8號”和中國甜柿“鄂柿1號”花粉為試材，采用L9(34)正交試驗設計和懸滴培養(yǎng)法，篩選花粉離體萌發(fā)最適合的蔗糖、硼酸和硝酸鈣濃度組合；此外，比較碘-碘化鉀(I2-KI)和TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)染色法在花粉活力快速檢測中的應用價值，以期為中國甜柿遺傳改良中花粉活力的檢測提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以華中農(nóng)業(yè)大學柿圃“雄株3號”(D.kakiThunb.“Male 3”)、“雄株8號”(D.kakiThunb. “Male 8”)和“鄂柿1號”(D.kakiThunb.“Eshi 1”)為試驗材料。晴天上午從成年樹上采摘即將開放的雄花花蕾各15朵，分別裝入透明密封袋中密封標記，帶回實驗室后用鑷子取出花藥，室溫晾干，等花粉全部散出后，將其收集到1.5 mL離心管中，置入放有硅膠的容器中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩１驹囼灮ǚ垭x體萌發(fā)和染色法檢測活力均在花粉采集后3天內(nèi)進行。

1.2 方法

1.2.1 花粉離體萌發(fā)條件優(yōu)化 花粉離體萌發(fā)采用懸滴培養(yǎng)法。培養(yǎng)基(含1.0%瓊脂，pH=5.8)蔗糖、硼酸和硝酸鈣成分篩選采用L9(34)正交試驗(表1)。25 ℃暗培養(yǎng)3 h后統(tǒng)計花粉萌發(fā)率，每處理重復3次，每重復觀察5個視野，每視野花粉數(shù)大于50個。

表1 柿花粉離體萌發(fā)正交試驗設計因素和水平

花粉萌發(fā)率=(萌發(fā)花粉數(shù)/觀察花粉總數(shù))×100%

1.2.2 I2-KI染色法測定花粉活力 用發(fā)絲蘸取少量花粉置于潔凈的載玻片上，輕輕滴1～2滴I2-KI溶液，輕輕搖勻后蓋好蓋玻片，置于25 ℃恒溫箱中，20分鐘后置于光學顯微鏡下觀察。被染成藍色的花粉具有活性，黃褐色的花粉無活力[13]。

1.2.3 TTC染色法測定花粉活力 用發(fā)絲蘸取少量花粉置于潔凈的載玻片上，輕滴1～2滴0.5% TTC溶液，搖勻后蓋好蓋玻片，置于35 ℃恒溫箱中，30分鐘后置于光學顯微鏡下觀察。被染成紅色的花粉活力強，淡紅色的花粉活力較強，無色則沒有活力[14]。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析；百分率數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為反正弦數(shù)據(jù)再進行統(tǒng)計分析。根據(jù)試驗結(jié)果求得極差(R)，極差越大，該因素對試驗影響程度越大。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基組分對離體花粉萌發(fā)的影響

由表2、3、4可知，對“雄株3號”與“雄株8號”花粉離體萌發(fā)率而言，蔗糖濃度的影響最大，硼酸次之，硝酸鈣最小；對“鄂柿1號”而言，蔗糖濃度影響最大，硝酸鈣次之，硼酸最小。因此，蔗糖濃度是影響供試品種花粉萌發(fā)的主要因素；3種柿種質(zhì)花粉在試驗處理8的蔗糖、硼酸、硝酸鈣濃度配比條件下花粉離體萌發(fā)率均最高，也最利于花粉管生長(圖1)。由此得出3種柿種質(zhì)花粉離體萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基組成：蔗糖200 g/L，硼酸150 mg/L，硝酸鈣100 mg/L。

圖1 “鄂柿1號”花粉在試驗處理2(A)和處理8(B)的萌發(fā)狀況

表2 “雄株3號”懸滴培養(yǎng)正交試驗統(tǒng)計分析

表3 “雄株8號”懸滴培養(yǎng)正交試驗統(tǒng)計分析

表4 “鄂柿1號”懸滴培養(yǎng)正交試驗統(tǒng)計分析

2.2 不同染色方法對雄性柿種質(zhì)花粉活力檢測結(jié)果的影響

采用I2-KI染色法對“雄株3號”和“雄株8號”花粉進行染色，蓋好蓋玻片，放置20分鐘后，在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)有部分花粉變?yōu)樗{色，但變色程度不明顯，區(qū)分度不十分明顯(圖2)，兩種花粉的著色率分別為21.6%和25.8%(見表5)。該方法雖然速度快，但并不能準確地表示花粉活力，也不適合于研究某單一處理對花粉活力的影響。因為三核期退化的花粉已有淀粉積累，遇碘同樣呈藍色。即使花粉沒有活力也能被染成藍色。

表5 不同染色法測定的完全雄株柿種質(zhì)花粉活力

圖2 I2-KI(A)和TTC(B)染色快速檢測柿花粉活力比較

采用TTC染色法對“雄株3號”和“雄株8號”花粉進行染色，攪拌均勻后蓋上蓋玻片放置于35 ℃恒溫箱中，30分鐘后鏡檢，觀察到部分花粉被染成紅色，染色程度也有差別。兩種花粉的著色率分別為31.5%和26.0%。該方法相對于淀粉碘化鉀染色法更為準確，因為可以排除三核期退化的花粉中的淀粉影響，而且可以根據(jù)染色的深淺來判斷花粉的活力狀況，顏色越深，花粉的活力越強；顏色越淺或局部染色，花粉的活力越弱。但該方法耗時略長。

3 結(jié)論與討論

糖類物質(zhì)是花粉粒萌發(fā)及花粉管壁合成的主要營養(yǎng)物質(zhì)[15]。硝酸鈣和硼酸是花粉萌發(fā)所需的礦質(zhì)元素[16]。鈣離子的動態(tài)變化對花粉萌發(fā)啟動、花粉管的生長調(diào)節(jié)具有重要作用[17-18]。本試驗結(jié)果表明，蔗糖對“雄株3號”“雄株8號”和“鄂柿1號”花粉的萌發(fā)影響顯著，而且隨著蔗糖濃度的升高，花粉離體萌發(fā)率也隨之升高。統(tǒng)計分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種中國原產(chǎn)雄性柿種質(zhì)花粉離體萌發(fā)最適宜的培養(yǎng)基組合為蔗糖含量為200 g/L，硼酸含量為150 mg/L，硝酸鈣含量為100 mg/L，其中蔗糖的含量為決定性因素。

花粉活力可根據(jù)花粉所染顏色來快速判定，這種方法的優(yōu)點在于簡單、迅速，但由于受花粉自身的特性影響，結(jié)果會出現(xiàn)一定程度的偏差。I2-KI染色法測得“雄株3號”的花粉活力弱于“雄株8號”，但用TTC染色法時，測得的“雄株3號”的花粉活力強于“雄株8號”。不同品種花粉粒內(nèi)的淀粉含量不同，雖然花粉失去了活力，但由于其花粉粒內(nèi)的淀粉依然存在，同樣會呈現(xiàn)藍色而使得測定值偏高[19]。I2-KI染色法測定需要時間更短，TTC染色法其次，本試驗二者測定出來的花粉活力并無明顯差異，均顯著低于懸滴法測定的花粉活力，這可能與個體花粉外壁太厚，染色劑未能進入花粉細胞內(nèi)有關。

3種方法的花粉活力測定速率為I2-KI染色法最快，TTC染色法其次，懸滴培養(yǎng)法最慢。適合“雄株3號”“雄株8號”“鄂柿1號”花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基是蔗糖200 g/L+硼酸150 mg/L+硝酸鈣100 mg/L。I2-KI染色法和TTC染色法均可用于快速測定柿花粉活力，兩種方法測定的花粉活力低于懸滴培養(yǎng)法。I2-KI和TTC染色法可以快速判定花粉的活力，在柿雜交育種中可作為快速初步判定花粉活力的方法，再結(jié)合懸滴培養(yǎng)法較為準確地測定花粉活力，為柿遺傳改良中花粉活力的檢測提供科學依據(jù)。