不同干預治療對PCOS大鼠血管生成素樣蛋白2表達的影響

王丹丹 柴淑娟 郭秋炎 衛項龍 郭藝紅 申 科 李艷春 趙瑞欽

1 河南中醫藥大學第三附屬醫院，河南省鄭州市 450008；2 舞陽縣婦幼保健院生殖科; 3 鄭州大學第一附屬醫院

多囊卵巢綜合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)是育齡期女性最常見的內分泌代謝紊亂疾病之一，臨床表現高度異質性，表現為月經紊亂、無排卵或稀發排卵、雄激素過多、不少患者伴有胰島素抵抗、血脂代謝異常等[1]，嚴重影響育齡期女性患者的生活質量。目前其病因尚未闡明，深入探討PCOS的生理病理改變及其可能分子機制，尋找治療和預防的新靶點，一直是生殖內分泌研究的熱點。

多數觀點認為全身和卵巢組織局部胰島素抵抗(IR)的存在[2]是PCOS發生、發展的關鍵病理機制，導致卵巢功能紊亂及排卵異常。PCOS卵巢局部IR主要是因為胰島素信號轉導通路障礙，可能與胰島素、PI3K及葡萄糖轉運蛋白4信號轉導關鍵分子受損有關[3-4]。L磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)是一個重要的胰島素信號轉導通路，PI3K/AKT信號通路磷酸化減少是PCOS患者胰島素抵抗(IR)的主要特征。卵泡的發育過程不僅需要激素、信號轉導的調節，新生血管提供充足的營養也是卵泡發育所必需的。血管生成樣蛋白(Angioprotein-like protiens,ANGPTLs)是一類血管生成相關的分泌性糖蛋白，與血管發生關系密切。目前多數研究認為脂肪組織中的ANGPTL2能夠介導脂肪組織慢性炎癥的發生，促進與肥胖相關的IR[5]。但對于PCOS患者ANGPTL2是否通過PI3K/AKT信號轉導途徑來介導卵巢組織局部IR從而影響卵泡的發育目前尚未見相關的報道。

本實驗研究通過來曲唑建立PCOS大鼠動物模型，應用二甲雙胍和中藥分別進行干預，通過適時熒光定量聚合酶鏈反應(Qrt-PCR)檢測PCOS大鼠和中西醫干預治療后的卵巢組織中的ANGPTL2、PI3K、AKT以及Foxol的mRNA差異性表達，探討ANGPTL2是否通過PI3K/AKT信號途徑來影響卵泡的發育及ANGPTL2與PCOS和胰島素抵抗的相關性，同時探討中西醫不同干預治療對ANGPTL2表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 選21d齡雌性SD清潔級大鼠60只，體質量180～200g，由鄭州大學動物實驗中心提供，生產許可證號：SYXK(豫)2015—0005。2019年4—5月底在河南中醫藥大學第三附屬醫院動物實驗中心飼養，標準飼料喂食。60只SD大鼠適應性喂養1周，采用隨機數字表法分為空白對照組(NC)10只和實驗組50只，空白對照組給予常規飼料喂養，飲水及食物自由攝取，實驗組待造模完成后重新編號根據隨機數字表法將大鼠分為模型對照組、西藥組、中藥組(高濃度中藥組、低濃度中藥組)、中藥+西藥聯合用藥組各10只，實驗過程中飲水及食物自由攝取。

1.2 主要實驗藥物制備 來曲唑(芙瑞)，羧甲基纖維素(sigma公司提供)。補腎化瘀方(沙苑子、枸杞子、菟絲子、茺蔚子、澤蘭、澤瀉、土鱉蟲、丹皮、甘草)藥物由河南中醫藥大學第三附屬醫院中草藥房提供，藥物煎制與濃縮由河南中醫藥大學第三附屬醫院藥劑科按照操作標準進行，根據人與大鼠之間用藥劑量換算系數公式(大鼠劑量=6.3×人的劑量mg/kg)換算實驗給藥劑量。二甲雙胍組4.498mg/ml(等效劑量換算)；補腎化瘀方高濃度組(2倍等效劑量)1.98g/ml，中濃度組(1倍等效劑量)0.989g/ml，低濃度組(1/2倍等效劑量)0.494 5g/ml。

1.3 實驗方法 實驗組大鼠灌胃服用來曲唑1mg/(kg·d)溶于1%羧甲基纖維中，連續灌胃21d，自造模1周后開始每天觀察大鼠陰道脫落細胞涂片。造模結束后次日開始給藥：空白對照組和模型對照組給予生理鹽水0.01ml/(g·d)灌胃；西藥組給予二甲雙胍溶液0.01ml/(g·d)灌胃；中藥組分別給予高濃度和低濃度補腎化瘀方0.01ml/(g·d)灌胃；中西醫組分別給予二甲雙胍溶液0.01ml/(g·d)和中濃度補腎化瘀方0.01ml/(g·d)灌胃，連續灌胃21d。大鼠灌胃21d后，當晚8：00禁食，次晨8：00稱重后10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血5～8ml，靜置30min后離心得到血清，-80℃凍存備用。取大鼠雙側卵巢組織，一只迅速投入液氮中，2h后置于-80℃冰箱凍存備用，另一只卵巢組織固定于體積分數4%多聚甲醛中以備后續試驗用。

1.4 指標檢測

1.4.1 血清胰島素水平：采用酶聯免疫法(ELISA)檢測血清胰島素水平，按試劑盒說明書步驟進行。

1.4.2 卵巢組織中ANGPTL2、AKT、Foxol mRNA表達情況：采用研磨法提取mRNA，測定濃度和純度，按照反轉錄試劑盒說明書配制反轉錄體系20μl，反轉錄條件：50℃ 2min，95℃ 10min，95℃ 30s，60℃ 30s，40個循環。PCR擴增引物核苷酸序列見表1。

表1 PCR擴增引物核苷酸序列表

1.4.3 卵巢組織中ANGPTL2、AKT、Foxol 蛋白表達情況：采用Westen-blot 法檢測卵巢組織中ANGPTL2、AKT、Foxol 蛋白表達水平。提取卵巢組織中總蛋白，測定蛋白濃度，根據總蛋白濃度計算樣品蛋白濃度，將提取的蛋白上清完全變性后-20℃保存。用微量加樣器將制備好的蛋白樣品和MAKER加入上樣孔電泳，各樣品總蛋白量為40μg。在轉模槽內將蛋白轉印至PVDF膜內，然后免疫印跡染色，晾干膠片，掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值。

2 結果

2.1 各組大鼠血清胰島素含量 與空白對照組相比，其余各組大鼠血清胰島素含量顯著升高(P<0.05)；與模型對照組相比，各治療組血清胰島素水平明顯下降(P<0.05),以中西藥聯用效果最佳,見表2。

表2 各組大鼠血清胰島素含量

2.2 各組大鼠卵巢組織中ANGPTL2、AKT、Foxol mRNA及蛋白表達水平 與空白對照組相比，模型對照組、中藥組及中藥+西藥組大鼠卵巢組織中ANGPTL2、AKT、Foxol mRNA及蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型對照組相比，各治療組大鼠卵巢組織中ANGPT L2、AKT、Foxol mRNA及蛋白表達水平明顯下降(P<0.05),西藥組效果最佳，見表3、圖1。

表3 各組大鼠卵巢組織中ANGPT L2、AKT、Foxol mRNA表達水平

圖1 各組大鼠卵巢組織中ANGPTL2、AKT、Foxol蛋白表達水平

3 討論

目前多數學者認為PCOS是IR相關的代謝綜合征，會導致不孕、胰島素抵抗、肥胖和心血管等一系列健康問題，嚴重影響了育齡期女性生活質量，其發病原因和機制復雜，研究表明IR 對PCOS患者的生育和代謝功能有顯著的影響，特別是伴有肥胖者，這種影響更大[6]。

血管生成素樣蛋白2(ANGPTL2)是血管生成素樣家族的成員，是一種脂肪組織衍生的分泌糖蛋白[7]。ANGPTL2的主要功能是血管重塑和組織修復，不過，最近的研究表明過量的ANGPTL2信號介導慢性炎癥以及隨后的病理不可逆組織重塑，推測其可能在PCOS的發病中起著特殊的作用。本實驗中發現，與正常對照組相比，PCOS組大鼠血清胰島素水平明顯升高，卵巢組織中ANGPTL2蛋白表達也明顯升高，表明ANGPTL2可能通過影響胰島素的抵抗性，引起卵巢內及其周圍脂質代謝的異常，從而影響 PCOS患者卵泡的正常發育。中藥和西藥治療后，各治療組血清ANGPTL2和胰島素水平均有不同程度的下降，表明抑制體內ANGPTL2的表達可以改善體內胰島素的敏感性，意味著ANGPTL2可能是PCOS患者發生胰島素抵抗的一個重要的脂源性感染介質，與PCOS的病程發展關系密切。Liu Z等學者曾在PCOS患者的CCMⅡ中檢測ANGPTL1和ANGPTL2基因的差異性表達，結果只有ANGPTL2顯著高表達，說明ANGPTL2可能更能影響PCOS患者顆粒細胞的成熟發育[8]。這與本研究結果相一致。

雖然許多學者認為IR是PCOS發病的關鍵因素，但IR并不能解釋PCOS的所有臨床特征。可能IR只是PCOS發病機制的一部分，信號通路改變可能才是PCOS發病機制的關鍵因素。PI3K-Akt信號通路的改變與胰島素抵抗(IR)、糖尿病和代謝紊亂密切相關[9]。ANGPTL2可以通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號途徑對人的臍靜脈內皮細胞發揮抗凋亡作用[10]。但ANGPTL2是否也是通過PI3K/Akt信號途徑在PCOS的致病過程中發揮作用，尚未見此類報道。本研究發現與空白對照組相比，模型對照組大鼠卵巢組織中與凋亡相關的Foxol表達明顯升高，AKT表達也明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。用二甲雙胍和中西醫治療干預后，兩者的表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，這與ANGPTL2表達相一致。說明ANGPTL2可能通過PI3K-Akt途徑影響卵泡生發泡破裂(GVBD)減數分裂過程[11]，過量ANGPTL2可抑制AKT從而限制GVBD，進而影響卵泡發育[12]。由此可以推測ANGPTL2基因與PCOS的致病過程具有一定的相關性。

PCOS發病機制復雜，臨床異質性較大，給診斷和治療帶來很多困難。多數患者對長期服用激素類藥物心有抵觸，且停藥后容易復發，故更愿意接受中藥治療。隨著中醫對PCOS研究的不斷深入，認為腎虛血瘀是PCOS的基本病機[13]，多數研究已經證實補腎化瘀方對多囊卵巢綜合征病例療效顯著。本實驗結果顯示：與模型對照組相比，各治療組均能不同程度改善PCOS大鼠體內IR，并能降低卵巢組織中ANGPTL2水平，在改善IR方面以中西藥聯合用藥最為明顯，而在降低卵巢組織中ANGPTL2及相關信號通路方面，則以西藥組最明顯(P<0.05)。推測補腎化瘀方可能減輕卵巢組織局部因血液瘀滯產生的炎癥從而改善胰島素抵抗達到治療PCOS的目的。但是該方劑使血流通暢的同時是否又促使了新生血管的產生，從而間接引起ANGPTL2的生成增多，具體機制則需要更深一步的研究。

綜上所述，ANGPTL2可能通過PI3K/AKT信號通路，影響凋亡基因表達和胰島素抵抗，在PCOS的發生發展中起著不可忽視的作用，或許血循環中ANGPTL2水平可成為一種新的監控PCOS病程進展的小分子物質。補腎化瘀方聯合二甲雙胍可以明顯降低PCOS大鼠體內胰島素水平，但是否促進ANGPTL2的表達尚需要進一步深入研究。