TNF-α和TGF-β1基因多態性與關節假體無菌性松動、假體周圍骨溶解的相關性分析*

吳國忠 王文懷 黃 隆 方凱彬 施勁楠

福建醫科大學附屬第二醫院骨科，福建省泉州市 362000

人工關節置換手術已經成為醫學領域中一項非常重要且已發展成熟的外科技術，但人工關節置換術后10年仍約有10%患者會出現假體無菌性松動、假體周圍骨溶解現象。目前病因尚不明確，文獻報道導致人工髖關節松動的原因大致可分為機械因素和生物學因素兩大類。機械因素包括：假體設計、術中操作、應力遮擋等；生物學因素主要包括：假體材料及其產生的磨損顆粒所引起的無菌性炎性反應。磨損顆粒誘發假體周圍組織產生一系列生物學反應是導致假體周圍骨溶解、假體無菌性松動的主要原因，但機制目前還未明確。大部分關節假體可長期生存，但相同使用年限，不同個體發生骨溶解程度及概率并不相同，嚴重程度也差別明顯。除了年齡、性別、營養狀態、活動水平、生化代謝差異對關節置換術后假體無菌性松動、骨溶解存在影響外，個體的遺傳因素在磨損顆粒引發的慢性炎癥識別、反應也具有差異性。已有的研究證實多種基因單核苷酸多態性，不同基因表型與假體松動、假體周圍骨溶解相關，說明不同的基因表型在磨損顆粒導致骨溶解的炎癥反應存在差異性，不過目前這些研究的對象均為歐洲高加索人種且樣本量較小，缺乏有關亞洲及中國人群的研究。巨噬細胞吞噬磨損顆粒，釋放多種細胞因子，引起一系列炎癥反應，其中TNF、TGF作為炎癥因子，在炎癥免疫中起著重要作用，但由于個體之間對聚乙烯磨損顆粒的反應存在很大差異[1]，只有少部分患者發生假體無菌性松動、假體周圍骨溶解。這種個體差異是否與TNF-α、TGF-β1基因多態性相關，目前尚不明確。為此筆者采用病例對照回顧性分析研究的方法，探討了TNF-α基因238 G/A位點[2]、TGF-β1基因+869T/C、+915G/C位點的單核苷酸多態性[3]與人工髖關節假體無菌性松動、假體周圍骨溶解是否存在相關性。現將研究報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年8月1日—2020年12月31日在我院隨訪到的人工髖關節置換術后假體松動、假體周圍骨溶解患者共20例作為觀察組。納入標準：(1)經臨床癥狀、體格檢查及影像學檢查綜合評估，符合髖關節假體無菌性松動、假體周圍骨溶解診斷標準[4-6];(2)均自愿參加本次研究并簽署知情同意書。排除標準：(1)假體周圍感染導致的假體松動病例；(2)不愿參加研究。同期另取我院髖關節置換術后隨訪5年以上，并且假體牢固的患者30例作為對照組。所有研究對象均為福建地區漢族人，其職業、文化程度不限。兩組患者的一般資料比較無統計學差異(P>0.05)，見表1。本研究方案獲得醫院倫理委員會的批準，所有入院患者均簽署知情同意書。

表1 兩組患者的一般情況比較

1.2 儀器及試劑 本研究采用下列儀器及試劑：高速低溫離心機(5840R，Sigma公司)；T100 PCR儀(BIO-RAD公司)；全自動凝膠成像儀(北京賽智創業科技有限公司)；水平電泳裝置(北京市六一儀器廠)；JA-2003電子分析天平(沈陽龍騰電子有限公司)；海爾MI-2270M(N)微波爐(青島海爾集團)；微量紫外—可見光分光光度計[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix，2×TransStart FastPfu PCR SuperMix(-dye)，Agarose，GelStain，DNA Loading buffer，Trans2K DNA Marker(北京全式金有限公司)；血液基因組 DNA 提取試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)；無水乙醇(西隴科學股份有限公司)。

1.3 實驗材料和方法

1.3.1 提取基因組：抽取患者外周靜脈血2ml，置入含乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝劑的真空無菌管中混勻，-80℃保存備用。參照說明書用血液基因組DNA 提取試劑盒提取基因組。(1)將-80℃凍結的樣品拿出后，室溫解凍。(2)加20μl Protein K，500μl BB3及10μl Rnase A于2ml 的樣品中，渦旋15s混合均勻，室溫孵育10min。(3)短暫離心，將全部的溶液加入離心柱中，12 000g離心1min，棄流出液。(4)加入500μl溶液CB3，12 000g離心30s，棄流出液。(5)加入500μl溶液WB3，12 000g離心30s，棄流出液。(6)再加入500μl溶液WB3，12 000g離心30s，棄流出液。(7)12 000g離心2min，徹底去除殘留的WB。(8)將離心柱置于一個干凈的1.5ml離心管中，在柱的中央加入50～200μl預熱的EB(60～70℃)，室溫溫育1min，2 000×g離心1min，洗脫DNA。(9)提取的DNA可直接用于各種下游應用實驗，如不立即使用，請于-20℃保存。

1.3.2 引物設計及合成：在NCBI的Gene數據庫中找到TNF-α基因及TGF-β1基因序列。查詢TNF-α基因ID為7124，根據基因序列設計引物序列，TNF-α(238)設計上游為 5’-GCCCCTCCCAGTTCTAGTTC-3’，下游為 5’-TCATCTGGAGGAAGCGGTAG-3’，片段大小319bp。查詢TGF-β1基因ID為7040，根據基因序列設計引物序列，TGF-β1(869和915)上游為5’-GCATCCTAGACCCTTTCTCCTC-3’，下游為 5’-TGGCGTAGTAGTCGGCCTC-3’，片段大小621bp。

1.3.3 PCR技術：將提取的cDNA稀釋5倍作為PCR的模板，按2×TransStart FastPfu PCR SuperMix(-dye)的說明書配制qPCR反應液，總反應體系20μl。反應程序如下：95℃預變性2min；變性95℃ 20s，退火60℃ 20s，72℃ 15s，共30個循環；72℃延伸5min。使用T100 PCR儀，擴增目的基因。根據引物設計及合成，得知TNF-α包含238位點的基因片段大小為319bp，TGF-β1包含+869和+915位點的基因片段大小為621bp。利用設計合成的引物成功擴出了目的基因片段。

1.3.4 PCR產物測序：一代測序Sanger法即雙脫氧末端終用做止法，對每個樣品的pCR擴增產物進行測序，用DNAMAN8軟件分析比較DNA測序結果，確定觀察組及對照組樣本TNF-α(238G/A)，TGF-β1(+869T/C和+915G/C)3個基因位點的基因型。

1.4 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件分析處理所得數據，兩組數據比較采用χ2檢驗，P<0.05時有統計學差異。

2 結果

對TNF-α基因238G/A位點基因型分析，由于AA基因型理論數<1，采用Fisher確切概率法進行統計結果分析，得出P>0.05，提示差異無統計學意義，尚不能認為觀察組、對照組TNF-α基因238G/A位點基因型存在相關性。TGF-β1+869T/C、+915G/C兩個基因位點未發現SNP多態性。兩組基因型分布情況見表2。

表2 兩組基因型分布情況

3 討論

3.1 關節假體無菌性松動、假體周圍骨溶解的病因探討與處理 關節假體無菌性松動、假體周圍骨溶解是初次人工關節置換術后失敗和翻修手術最常見的原因[7]，其病因尚不清楚。有研究認為磨損顆粒在假體周圍無菌性松動、骨溶解起到關鍵作用[8-9]。磨損顆粒通過吞噬作用或模式識別受體作用于巨噬細胞，引起多種趨化因子和炎性介質釋放,啟動骨質溶解的進程[10]。磨損顆粒引發的骨溶解本質上是異物排斥反應的一種。磨損顆粒被巨噬細胞吞噬后，產生一系列炎癥因子，誘導骨溶解及無菌性松動，而大的顆粒雖不被吞噬，但能被巨噬細胞所包裹，同樣能刺激巨噬細胞分泌炎癥因子，引起炎癥反應。要控制骨溶解現象，需減少磨損顆粒的產生及其生物學反應。植入物設計、手術因素、患者因素均對磨損顆粒的形成造成影響。優化設計和改良關節假體材料，提高耐磨性，規范手術操作，降低患者體重指數，避免關節置換術后過度使用，藥物治療，均是減少磨損顆粒的重要手段。

3.2 TNF-α、TGF-β1與關節假體無菌性松動、假體周圍骨溶解 有研究提出與骨關節炎患者不同，髖關節假體無菌性松動患者局部有特殊的炎癥反應和神經支配現象，提示神經免疫相互作用，揭示潛在的作用機制及靶向治療手段，以改善髖關節假體的壽命和治療假體無菌性松動[11]。炎癥細胞因子TNF-α、TGF-β1是重要的影響骨代謝的因子，在假體周圍骨溶解的慢性炎性骨吸收發揮了重要作用。人類基因轉錄活性的升高或降低與該基因啟動子中的SNP有關，蛋白質編碼區的SNP可能會使其翻譯后關鍵的功能基團氨基酸序列發生變化，使蛋白質結構發生變化，影響蛋白質的功能，導致人體對特定環境或病因的敏感性增加，從而致病。

TNF-α是一種主要由單核細胞、巨噬細胞和淋巴細胞分泌，且有廣泛生物學活性的細胞因子，廣泛參與誘導炎癥和免疫調節。啟動子區的基因多態性與基因轉錄活性增強及基因水平的增加有關，在TNF-α啟動子238位點等位堿基呈現多態性，有GG、GA、AA 3種不同基因型[12]。本研究中TNF-α 238觀察組 GG基因型18例，AA基因型2例，對照組30例基因型均為 GG，兩組基因型數據對比無統計學差異，故不能認為TNF-α 238單核苷酸多態性與關節假體無菌性松動、假體周圍骨溶解存在相關性，即還不能認為TNF-α 238(G/A)位點AA基因型是關節假體松動、周圍骨溶解的遺傳危險因素。

轉化生長因子(TGF-β1)是一個多效的細胞因子，影響細胞的生長、分化和細胞外基質的合成，是重要的骨代謝調節劑，調節成骨細胞生化與增殖，抑制破壞細胞前體的形成及骨吸收。該TGF-β1基因定位于染色體19q13，具有遺傳多態性，由7個外顯子和6個內含子組成，編碼區的基因多態性可引起編碼蛋白的差異，影響疾病的產生或嚴重程度。TGF-β1基因SNP的存在可能通過影響TGF-β1在血清中的表達量，影響假體周圍局部骨質代謝，使骨細胞功能受損，引起假體周圍骨溶解、假體松動的發生。目前研究發現TGF-β1至少存在8個常見基因多態性位點，其中+869T/C以及+915G/C是研究較多的2個基因多態性位點。TGF-β1在體內產生量的多少可能與TGF-β1+869，+915位點的基因多態性相關[3]。但在本研究中觀察組及對照組TGF-β1基因+869 T/C位點均為CC基因型，在+915G/C位點均為GG基因型，暫未發現基因多態性，故不能認為TGF-β1+869、+915位點的單核苷酸多態性與關節假體無菌性松動、骨溶解發病存在相關性。

3.3 本研究的潛在價值 目前關節假體植入后骨溶解現象尚無有效的生物學檢測指標，無法進行早期干預治療，并且無法有效評估治療效果，故當患者出現明顯松動癥狀而就診時，通常原關節假體已無法保留，只能依靠翻修手術恢復關節功能。本研究目的討論分析TNF-α 238G/A、TGF-β1+869T/C、+915G/C共3個基因位點的單核苷酸多態性與關節假體無菌性松動、假體周圍骨溶解發病風險的相關性，為其發病尋找危險遺傳基因類型提供科學依據，當相關危險易感基因明確后，可早期預警，提前藥物介入或在基因個體化治療提供新思路，應用價值巨大。

在關節假體植入術前，檢測關節假體無菌性松動、假體周圍骨溶解發病相關的危險遺傳基因類型，提前干預，降低宿主對磨損顆粒的慢性炎癥反應。如可通過選擇特殊類型關節假體，有文獻用地塞米松作為抗炎藥物洗脫的人工關節種植系統相關研究，以防止磨損顆粒引起的假體周圍骨溶解[13]，或選用重組人骨形態發生蛋白-2特殊涂層的股骨柄假體以降低假體松動風險[14]。對已經行人工關節置換的患者，檢測相關危險遺傳基因類型，對具有危險因素患者可提前藥物介入處理，通過抑制骨吸收、促進骨生成和抑制炎癥反應，可選擇雙膦酸鹽類藥物、骨形態發生蛋白、他汀類藥物、TNF-α拮抗劑及環氧化酶抑制劑等。已有文獻報道基因治療的相關研究，由慢病毒介導的靶向TNF-α基因的shRNA基因治療可能為無菌性關節松動提供一種新的治療方法[15]。

3.4 本研究的局限性及改進方向 本研究具有一定的局限性，樣本量小，只限于福建地區漢族人群，僅探討了觀察組與對照組TNF-α 238、TGF-β1基因+869、+915共3個位點的單核苷酸多態性，本實驗沒有涉及觀察組與對照組中患者TNF-α、TGF-β1的分子表達水平差異，也沒有涉及兩組患者免疫細胞的炎癥反應差異。因此，該研究需要增加樣本量，增加不同地區人群，擴大基因檢測位點，并對關節假體無菌性松動、假體周圍骨溶解發病與易感基因型是否相關，在分子表達水平、細胞反應水平上作更深入研究。目前本研究結果尚不能認為這3個基因位點單核苷酸多態性與關節假體無菌性松動、假體周圍骨溶解發病存在相關性，因為影響關節假體長期生存的遺傳因素可能有多種基因參與，最終結果可能是由多種基因參與的結果，文獻報道假體周圍骨質溶解的個體差異性可能與IL-1RA基因、IL-6基因、基質金屬蛋白酶—基因的單核苷酸多態性有關[10]。但目前由于人力、研究經費的限制，進一步開展此類相關研究難度較大。

綜上所述，目前尚不能認為TNF-α 238、TGF-β1+869、+915位點的單核苷酸多態性與關節假體無菌性松動、假體周圍骨溶解發病存在相關性，其發病可能潛在易感基因有待進一步深入研究明確。