啟動急性痛風發作炎性細胞因子的研究*

陸群群 張 永 李 琳 李曉玲 方 旋 張 敏 項 楠 朱子文 陶金輝,

1 安徽醫科大學附屬省立醫院風濕免疫科,安徽省合肥市 230000; 2 安徽省宿州市立醫院風濕免疫科;3 安徽醫科大學第二附屬醫院風濕免疫科; 4 中國科學技術大學附屬第一醫院風濕免疫科

痛風是一種與嘌呤代謝障礙相關、以關節炎為主要表現的炎癥性疾病。長期嘌呤代謝活躍、嘌呤攝入過多或尿酸排泄障礙，均可導致高尿酸血癥，而長期高尿酸血癥會引起關節及周圍軟組織尿酸鹽(MSU)晶體的沉積，導致反復發作的急性關節和軟組織炎癥、痛風石沉積、慢性關節炎和關節損壞等。

目前普遍認為有多種炎性細胞因子參與了痛風的發病，但尚不明確是否都參與了該病炎癥反應的啟動。細胞因子的產生與 NALP3炎癥小體的激活有關[1]，沉積在關節部位的MSU通過MSU-NALP3-IL-1β信號通路激活炎癥反應，誘導痛風的發作，IL-1β是導致痛風急性發作的主要炎癥性細胞因子[2]。痛風的病因和發病機制尚未明確，盡管MSU被公認是痛風發病的主要致病信號，但不能解釋臨床上存在的一些現象，比如：為什么某些患者關節內存在大量尿酸鈉晶體沉積抑或是痛風石形成，但卻沒有急性關節炎發作？我們課題組在前期的研究中發現ATP是除MSU外導致痛風發作的第二致病信號，ATP受體P2X7R的功能決定了高尿酸血癥患者是否會出現痛風發作[3]，臨床上5%～15%的高尿酸血癥患者會發展為痛風，而高尿酸血癥患者是否出現痛風發作，考慮到主要因機體對痛風致病信號協同刺激的反應不同，鑒于MSU和ATP均為痛風的致病信號，本研究主要通過MSU+ATP二者共同刺激痛風患者和從未有痛風發作的高尿酸血癥患者的外周血白細胞，通過分析培養液中的細胞因子濃度差異，探討不同細胞因子在痛風發作啟動中的作用，從而力求找到啟動痛風炎癥的細胞因子。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 課題組于2013年1月—2014年5月在安徽醫科大學附屬省立醫院(安徽省立醫院)共納入了80例男性患者，分為痛風組、高尿酸血癥組，每組40例，實驗中所納入患者采血前均知情同意。痛風組年齡15～74歲，平均年齡為(53.4±15.6)歲；高尿酸血癥組年齡24～77歲，平均年齡為(50.9±14.1)歲；兩組年齡構成比差異無統計學意義(P>0.05)，兩組間具有可比性。

1.2 選擇標準 納入標準：(1)痛風組均來自本院風濕科門診部和住院部，均符合2015年美國風濕病協會/歐洲抗風濕病聯盟(ACR/EULAR)提出的痛風診斷標準[4]，為排除痛風急性發作等干擾因素影響，鑒于痛風患者多以男性為主，本研究納入者均為穩定期男性痛風患者；(2)高尿酸血癥組作為對照組，均來自本院健康體檢中心及內分泌科等相關科室，鑒于痛風的發病主要在高尿酸血癥5年內發病，故納入者均為非同日兩次空腹血尿酸>420μmol/L(7mg/dl)的男性，病程均>10年且從未痛風發作，以確保入選的高尿酸血癥患者不會出現痛風急性發作。排除標準：患有感染、其他自身免疫性疾病及慢性消耗性疾病者等。

1.3 細胞刺激培養 本研究使用的白細胞均來源于痛風和高尿酸血癥患者的外周血：上午7:00采集痛風或高尿酸血癥患者外周靜脈血10ml，經乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝后于2h內進行處理。用沉淀法提取出白細胞，然后利用顯微鏡計數法，將之均分為2份后加入培養板中，并分別加入溶于培養基的尿酸鹽(MSU)和MSU+苯甲酰苯甲酸三磷酸腺苷(BZ-ATP)，使MSU終濃度為500μmol/L，BZ-ATP終濃度為200μmol/L，總體積達500μl；然后置于5% CO2、37℃培養箱內培養24h；最后抽取各孔內的細胞及培養基并離心，提取培養液，-80℃冷凍保存。

1.4 細胞因子檢測 采用多重液相蛋白定量技術(CBA)檢測細胞因子濃度。應用Human Inflammatory Cytokines Kit(美國BD公司生產，貨號：551811)，實驗按照CBA技術操作步驟進行，用PE標記的細胞因子抗體和樣本，在室溫下避光孵育3h，然后用流式細胞儀進行檢測，最后用CBA專用分析軟件FCAP Array v1.0進行標準曲線繪制及數據分析，即可得出細胞因子的濃度。

2 結果

2.1 單用MSU刺激外周血白細胞時，兩組培養液中不同細胞因子的濃度差異 單用MSU刺激時，痛風與高尿酸血癥患者組比較，IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的差異均無統計學意義(P均>0.05)，見表1。

表1 痛風與高尿酸血癥患者外周血白細胞單用MSU刺激后分泌細胞因子的比較

2.2 MSU+ATP共同刺激外周血白細胞時，兩組培養液中不同細胞因子的濃度差異 用MSU+ATP共同刺激時，痛風組培養液中IL-1β的水平較高尿酸血癥組顯著升高，差異有統計學意義(Z=-2.081，P=0.037)；但兩組培養液中IL-6、IL-8和TNF-α的濃度差異均無統計學意義(P均>0.05)，見表2。

表2 痛風與高尿酸血癥患者外周血白細胞用MSU+ATP刺激后分泌細胞因子的比較

2.3 單用MSU與MSU+ATP分別刺激痛風患者外周血白細胞時，培養液中不同細胞因子表達水平的比較 痛風患者組外周血白細胞單獨用MSU刺激與MSU+ATP共同刺激時,細胞培養液IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 痛風患者外周血白細胞用MSU+ATP刺激較MSU單獨刺激時分泌細胞因子的比較

2.4 單用MSU與MSU+ATP分別刺激高尿酸血癥患者外周血白細胞時，培養液中不同細胞因子表達水平的比較 高尿酸血癥患者外周血白細胞單獨用MSU刺激與MSU+ATP共同刺激時,細胞培養液IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的差異均無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 高尿酸血癥患者外周血白細胞用MSU+ATP刺激較MSU單獨刺激時分泌細胞因子的比較

3 討論

本研究結果顯示僅用MSU刺激痛風和高尿酸血癥患者的外周白細胞分泌的IL-1β水平無顯著差異，提示促使痛風的急性發作的致病因素可能不僅僅只是MSU；而當用MSU和ATP共同刺激時，痛風患者較高尿酸血癥患者外周白細胞分泌IL-1β的能力增加，不僅如此，痛風患者外周白細胞會分泌更高水平的IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α，這提示著ATP參與了痛風的發病，可能是引起急性痛風性關節炎發病的重要信號。

盡管MSU-NALP3-IL-1β信號通路參與了痛風發病，IL-1β理論上是啟動痛風發作的主要細胞因子[2]，但尚沒有直接證據予以證實。IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等多種細胞因子均參與了痛風的發病機制:在痛風病情活動時IL-6水平升高，也被認為是啟動痛風炎癥反應的主要細胞因子之一[5]；在痛風炎癥中TNF-α顯著升高，進而能促進IL-1β表達[6]；且IL-8是一種趨化性細胞因子，能夠趨化并激活中性粒細胞，促進中性粒細胞的溶酶體酶活性和吞噬作用，而在痛風炎癥過程中，中性粒細胞浸潤是其主要病理表現，亦有研究顯示在痛風發作期IL-8血清水平顯著升高[7]。盡管IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8都參與了痛風的發病，但尚不明確是否都參與了該病炎癥反應的啟動。

由于單獨MSU并不能引起痛風發病，因此難以在體外探尋啟動痛風炎癥的細胞因子。在我們前期研究提出并證實了ATP和MSU協同作用下誘導了痛風發作，特別是ATP受體P2X7的功能決定了痛風的發病[3]，而ATP能通過刺激單核細胞表面P2X7R誘導IL-1β分泌。因此本研究在體外采用ATP和MSU協同刺激痛風和高尿酸血癥患者的外周血白細胞，結果發現痛風患者細胞培養液中IL-1β水平顯著升高，而IL-6、IL-8和TNF-α水平變化在兩組中沒有顯著差異；且單用MSU刺激時，兩組細胞培養液中細胞因子均沒有差異。以上結果提示當高尿酸血癥患者對ATP刺激反應性更強、誘導產生的IL-1β更多時，才會引起痛風發作，進一步驗證了ATP是痛風發作的第二致病信號，IL-1β是痛風發作的主要細胞因子。

在痛風炎癥啟動階段IL-1β水平升高后，IL-1β可以誘導中性粒細胞聚集啟動炎癥反應，并且在MSU誘導炎癥的小鼠模型中，IL-1抑制劑可以阻止MSU誘導的中性粒細胞浸潤，但TNF抑制劑沒有此作用[8]，提示痛風炎癥啟動階段的中性粒細胞浸潤與IL-1β直接相關。IL-1β還可以通過炎癥級聯放大效應，誘導其他細胞因子產生并啟動炎癥反應，對啟動急性痛風性關節炎的發作發揮重要作用；IL-1β可以上調TNF-α表達，二者可以進一步通過不同途徑誘導IL-6和IL-8分泌[9]，引起炎癥加劇、痛風病情活動。IL-6、TNF-α等其他炎性細胞因子盡管是繼發于IL-1β產生的，但在痛風病情活動也發揮著重要作用，因此在臨床上，當痛風病情活動的患者使用TNF抑制劑或IL-6抑制劑治療時也是有效的[10-11]，提示這些細胞因子對痛風病情活動的不可或缺作用。

事實上在痛風炎癥的發展階段，繼發于IL-1β產生的炎性細胞因子的作用可能更為重要。因為當炎癥一旦啟動后，會造成機體組織的缺氧，組織缺氧會增加CD39和CD73的活性[12]，而CD39可將ATP轉化成ADP和AMP，AMP又可以被CD73進一步轉化成腺苷[13]，腺苷與ATP作用相反，它可以通過刺激P1受體來抑制IL-1β釋放[14]，因此在痛風炎癥發展期，IL-1β水平并沒有升高[5，7]，IL-1β不是致炎的主要細胞因子。目前臨床應用的三個IL-1β抑制劑anakinra、rilonacept 和 canakinumab均可以顯著抑制痛風發作[15-17]。因此本研究發現IL-1β是啟動痛風發作的炎性細胞因子，IL-1β抑制劑治療痛風的重點不在于抗炎，而在于預防痛風復發，這將有助于臨床醫師合理、正確地應用IL-1β抑制劑。