融合數據挖掘與網絡藥理學研究治療原發性肝癌中藥處方用藥規律

潘樹茂，章新友*，張玉嬌，牛曉錄，吳地堯，李秀云，丁 亮

(1. 江西中醫藥大學藥學院，南昌 330004； 2. 江西中醫藥大學計算機學院，南昌 330004)

肝癌是中國常見惡性腫瘤之一，以原發性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)為主[1]。長期的中醫臨床實踐，為中醫診療肝癌積累了豐富的經驗，并留有大量的中藥方劑信息[2]。

隨著信息技術的發展，數據挖掘技術在方劑配伍分析的運用日益成熟。常用的數據挖掘方法有關聯規則、回歸分析、決策樹、聚類分析、頻次分析和人工神經網絡等[3]。通過數據挖掘得出中藥的組方規律，為對中醫方劑配伍的研究提供參考。例如，榮震等[4]對榮遠明教授治療原發性肝癌的思路進行數據挖掘，發現榮遠明教授治法以“調肝理脾”為核心，輔治以“活血化瘀、清熱解毒、利水消腫、消食化滯”之法。網絡藥理學能從多成分、多靶點、多通路角度探索藥物治療疾病的作用機制，研究思路與中醫整體性、系統性的思想不謀而合[5]。例如，周玟等[6]基于網絡藥理學探討葛根治療肝癌的分子機制，發現葛根素可通過阻斷PTEN/Akt/GSK3β細胞信號轉導通路治療肝癌。

由于以往缺乏信息技術與網絡藥理學的融合，人們多數集中于對肝癌病因的研究和診療經驗的總結。迄今為止，缺乏對中醫治療原發性肝癌方劑用藥規律及其作用機制的深入研究。因此，現融合數據挖掘和網絡藥理學的方法，探究中醫治療原發性肝癌的中藥處方用藥規律，并從網絡藥理學角度分析其潛在的作用機制。并遵循中醫整體觀的思維方式，直觀地說明中藥多系統調控的作用機理，從西醫學靶點-疾病角度闡釋方證的關聯，旨在架起中、西醫學融合的橋梁，為中醫治療疾病的用藥規律和作用機制的研究開辟新徑。

1 材料與方法

1.1 處方來源和處方篩選標準

在南昌市3個區的3所省級三甲醫院中，篩選臨床治療原發性肝癌的有效中藥處方(剔除無效處方，即臨床診斷與用藥不符的處方；剔除相同處方，即排除同一醫生或同一科室的經驗用方)，得到有效的中藥處方共211個，并以此建立原發性肝癌處方數據庫(prescription database of primary hepatic carcinoma，PDOPHC)。

1.2 處方的錄入與核對

中藥存在同藥異名的情況，故在錄入系統前，先將PDOPHC中的中藥名稱規范化處理，例如：將“田七”規范為“三七”、“元參”規范為“玄參”，再將規范化后PDOPHC中的中藥處方數據導入中醫傳承輔助系統中。為確保中藥名稱輸入的準確性，數據審核與導入由兩人獨立進行，并對審核與錄入的數據進行校對，確保數據無誤。

1.3 數據分析

通過中醫傳承輔助系統[4]中的“方劑分析”功能，設置適當的置信度與支持度等參數，挖掘PDOPHC中的藥物使用頻次、常用藥對以及核心藥物組合(強關聯性的藥物組合和聚類分析的藥物組合)。

1.4 收集藥物化學成分

對于得到的核心藥物組合，選取置信度和頻次均高的雞內金，半枝蓮，茯苓，白術(簡稱JBFB)進行研究。白術、茯苓常一起配伍，以健脾補虛，其中白術多糖、茯苓多糖具有抗腫瘤、增強免疫、消炎等作用[7]。半枝蓮清熱解毒、活血化瘀、利尿，臨床上廣泛用于抗腫瘤的治療，半枝蓮黃酮、半枝蓮多糖、半枝蓮二萜、半枝蓮卟啉均有明確的抗腫瘤作用[8-10]。雞內金主含蛋白質、氨基酸及多種微量元素，有健脾消食、固精止遺、化堅消石之效[11]，張錫純常使用雞內金、白術相配伍治療脾虛、癥瘕積聚等。四藥聯用，符合臨床用藥規律，為其網絡藥理學的研究提供了依據。

以雞內金、茯苓、半枝蓮、白術為關鍵詞，通過中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP)(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)獲取四味中藥所含化學成分。以口服生物利用度(oralbioavilability，OB)和類藥性(drug-like，DL)作為篩選活性成分的重要指標，OB和DL越高，其開發利用程度越高，故以OB≥30%和DL≥0.18為條件進行，得到活性成分[12]。

1.5 構建成分對應靶標和PHC相關靶標庫

雙途徑獲取雞內金、茯苓、半枝蓮、白術活性成分的作用靶點。一方面，通過TCMSP數據庫獲得，將獲取的活性成分的作用靶點名稱輸入到UniProt數據庫，獲得其靶點的人源靶點名稱；另一方面，通過TCMSP數據庫篩選得到的活性成分，將其輸入到Swiss TargetPrediction平臺(http://www.swisstargetprediction.ch/)，預測藥物靶點。最后將兩者獲得的靶點匯總整理。

在人類疾病數據庫(MalaCards)(https://www.malacards.org/)、CTD數據庫(http://ctdbase.org/)、TTD數據庫(http://biddnus.edu.sg)、Pharm GKB數據庫(http://www.pharmgkb.org)中，將關鍵詞設置為“liver cancer”進行檢索，對結果篩選、去重、整理。即為PHC疾病靶標數據庫。

1.6 構建“活性成分-靶標”網絡圖

整理JBFB的活性成分及其作用靶點，輸入Cytoscape3.6.1軟件，構建活性成分-靶點的網絡圖。

1.7 構建蛋白互作網絡圖

將JBFB成分對應的靶標庫與PHC相關靶標庫導入String在線分析平臺(https://string-db.org/)，分別進行蛋白與蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)，取兩者的共同靶點，篩選得到與成分、PHC均直接相關的靶點為一般靶點。在Cytoscape3.6.1軟件上，采用CytoNCA插件對一般靶點進行拓撲參數分析和篩選，通過介度中心性(betweeness centrality，BC)、接近中心性(closeness centrality，CC)、度中心性(degree centrality，DC)和特征向量中心性(eigenvector centrality，EC)4個參數來評價一般靶點，篩選標準為DC大于2倍中位數、BC、CC及EC分別大于1倍中位數。在一般靶標中篩選得到核心靶標，將得到的核心靶點導入DisGeNET數據庫中(https://www.disgenet.org/)，以獲得靶點的類型信息。

1.8 分子對接驗證

利用RCSB PDB(http://www.rcsb.org/)數據庫下載核心靶點TP53(PDB ID：5AB9)、AKT1(PDB ID：3CQW)[13]的3D結構文件，并且通過Discovery Studio 4.5 Client剔除其中的配體化合物，保留其蛋白結構。根據度值排名，取排名靠前的化合物，在TCMSP數據庫下載其3D結構文件。將二者共同導入CB-DOCK(http://cao.labshare.cn/cb-dock/)在線平臺進行分子對接驗證。CB-DOCK網站[14]通過執行AutoDock Vina(1.1.2 版本)進行分子對接，進而預測給定蛋白和配體的結合位點。Vina 得分是Vina程序對受體和配體結合程度的評分，得分越低，說明受體和配體的親和力越高。

1.9 Gene ontology(GO)生物功能過程和KEGG代謝通路富集

將JBFB治療PHC的一般靶點導入DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)中，進行基因本體(GO)分析與京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，設定閾值P≤0.01，篩選出具有顯著性差異的富集結果。同時引入Reactome數據庫對篩選到的通路加以分析。結合上述結果以探究JBFB治療PHC可能的作用機制。

2 結果與分析

2.1 用藥頻次分析

通過中醫傳承輔助平臺對PDOPHC進行“頻次統計”，得到344味中藥，其結果按照從高到低的順序排列。使用頻次≥10的藥物有86味，如表 1所示。

表 1 使用頻次≥10的藥物Table1 TCM with frequency ≥10 in the PDOPHC

對高頻藥物進行分析，發現出現頻率較高的有清熱藥(夏枯草、白花蛇舌草、黃連等)、補虛藥(白術、鱉甲、枸杞子)、利水滲濕藥(茯苓、澤瀉、茵陳等)、活血化瘀藥(莪術、三棱、丹參等)、理氣藥(陳皮、香附、預知子等)。對344味中藥的性味歸經的研究分別從以下幾方面展開討論。首先對藥味進行分析，發現甘、苦、辛味的藥居多，中醫治療原發性肝癌多用補虛藥和清熱藥，甘“能補能和能緩”，補虛藥中甘味藥多見，苦“能泄能燥能堅”，清熱藥中苦味藥多見，由此可見，藥味的占比排名和其功效一致性較強。然后對藥性進行分析，發現總體用藥比較溫和，并無大寒、大熱之偏性用藥。其次對歸經進行分析，發現歸脾、肝、胃、腎經的居多，另外肺經所占比例亦較大，一般來說，中醫治療原發性肝癌多從肝、脾、腎入手，但根據五行生克理論，亦有“肺常不足，肝常有余”“怒傷肝，悲勝怒”之說，所以臨床常用補肺之法增強肺金的克制力量，同時配合清肝、瀉肝、疏肝等方法來平衡肝木的被克制力量，進而達到五行的動態平衡。這種肝病從肺論治的手段也體現了中醫的整體觀念，為中醫治療原發性肝癌提供了一個新的思路。故臨床常采用以甘、辛、苦和性溫的藥為主，從肝、脾、肺、腎等經共同論治。

2.2 基于關聯規則的方劑組方規律分析

應用關聯規則挖掘方法，將支持度個數設置為“26”，置信度≥0.6，共挖掘出239組常用藥對，取其中支持度個數≥50，共得到23組，這23組常用藥對均由高頻次的中藥組成，其中白術-茯苓藥對出現98次，頻次最高，支持度排列方式，如表 2所示。分析藥物組合的使用規律，得到486個藥物組合規則，取其中置信度≥0.95，共得到24組，結果如表 3所示。

表 2 原發性肝癌處方中常用藥對Table2 Commonly used TCM pairs in the PDOPH

表 3 基于關聯規則的原發性肝癌處方中的藥物組合Table3 Association rules on TCM in the PDOPHC

以支持度和置信度來看，藥物組合均具有強相關性。結合支持度和置信度進行分析，發現大多是補虛藥和利水滲濕藥、清熱藥、化痰止咳平喘藥、利濕退黃藥、理氣藥等藥物相配物。肝癌患者大多正氣虛弱，中醫各個醫家治標之法不盡相同，但是治本之法都是一樣的，均采用補虛之法以扶正固本。

結果中多是柴芍六君子湯(柴胡、白芍、人參、白術、茯苓、甘草、陳皮、半夏)的加減應用，與臨床治療相符。方中人參、白術、茯苓、甘草乃四君子湯之組方，具有益氣健脾之效；陳皮、半夏具有燥濕化痰之效；柴胡、白芍一散一收，具有疏肝柔肝之效。以上補虛藥與理氣藥、利水滲濕藥等藥物相互配伍，體現了中醫“見肝之病，知肝傳脾，當先實脾”的思想[15]。

2.3 基于復雜系統熵聚類的方劑組方規律分析

基于復雜系統熵聚類算法，將相關度設置為“7”，懲罰度設置為“1”，得到36個藥物組合，結果如表 4所示。

表 4 基于聚類分析的原發性肝癌處方中的藥物組合Table4 The key TCM combination in the PDOPHC

分析結果表明，主要是以補虛藥，清熱藥、活血化瘀藥為核心的藥物，臨床善于使用補虛藥、清熱藥、活血化瘀藥為主來治療原發性肝癌，故結果與臨床用藥相符合。以“莪術、三棱、鐵樹葉”為例，莪術、三棱，常在臨床上一起配伍，以加強其破血行氣的作用。莪術中含有的莪術醇、β-欖香烯、姜黃素具有抗腫瘤的作用，它們通過細胞毒作用、抑制腫瘤細胞增殖等多途徑發揮抗癌作用[16-17]。莪術、三棱提取液與白介素-6聯用可促進人乳腺癌細胞的凋亡，其誘導凋亡的作用比單獨用藥更強[18]。鐵樹葉，有理氣活血、化瘀消腫之效，其含有的鐵樹素和新鐵樹素甲乙，有一定的抗癌作用，朱晏偉等[19]發現鐵樹葉有促進細胞早期凋亡的作用。

2.4 藥物化學成分的篩選

通過TCMSP數據庫對JBFB中4味中藥化學成分及其ADME參數進行檢索，得到化學成分。以OB≥30%和DL≥0.18為指標對JBFB入血活性成分進行初步篩選，同時納入不符合OB、DL，但有藥理作用的化學成分，共得到57個生物活性成分。

2.5 PHC相關靶點的篩選

在MALAcards、CTD、pharm GKB、TTD數據庫中檢索與PHC相關的靶點，分別得到427、504、7、32個，匯總刪重，共得到882個。

2.6 治療PHC的JBFB成分的靶點篩選和分析

經TCMSP數據庫、String數據庫篩選，共獲得JBFB對應靶點698個，PHC相關靶點882個，分別作 PPI
圖，并且在“成分-靶點”網絡圖的基礎上與“疾病-靶點”網絡圖進行交互處理，得到JBFB治療PHC的124個一般靶點，如圖 1所示。對JBFB治療PHC的一般靶點進行拓撲參數分析，DC、BC、CC、EC的中位數值分別為16、27.596、0.481、0.495。選擇DC>32、BC>27.596、CC>0.481、EC>0.495，得到16個核心靶點，將靶點導入DisGeNET數據庫中(https://www.disgenet.org/)，獲得靶點的類型信息，結果如表 5所示。

圖 1 JBFB活性成分-靶點網絡及JBFB治療HPC的一般靶點Fig.1 Bioactive components-targets network of JBFB and general tagets for ingredients of JBFB for treatment of PHC

表 5 JBFB治療HPC的核心靶點Table5 Key targets about JBFB treatment for PHC

表 6 JBFB相關化學成分對接結果Table6 Molecular docking results of active components of JBFB

通過對核心靶點的功能進行分析：TP53、AKT1、MAPK1、MAPK3、STAT3、MYC、CASP3、MAPK8、JUN主要涉及細胞的轉錄調控及凋亡；CCND1、PTEN主要涉及細胞周期的調控。EGF、EGFR、VEGFA主要涉及血管生成。IL6、TNF主要涉及炎癥反應的調控。說明JBFB主要是通過誘導凋亡、阻滯周期，抗血管生成、調控炎癥的途徑來完成治療PHC。

2.7 分子對接驗證和分析

通過度值對化合物進行篩選，選取排名前七的化合物。同時選取核心靶點中的前兩個靶點。對兩者進行分子對接，對接結果詳見表 6。結果顯示，配體和受體之間均具有良好的親和力。其中熊果酸與受體蛋白的評分最高，其對接模式如圖 2所示。

參與對接的化合物大都具有抗癌活性。Casella等[20]發現，槲皮素可通過調控CCND1等多個基因，使G1期細胞數減少，從而使癌細胞的分裂周期停滯于G2/M期，達到預防肝癌發生的效果。Luo等[21]發現，槲皮素處理人肝癌細胞Hep G2后，可通過p53/mi R-34a(微小核糖核酸-34a)/SIRT1(沉默信息調節因子1)通路促進細胞凋亡。田新宇等[22]發現木犀草素和芹菜素均具有一定的抗癌活性。芹菜素經過甲醚化和溴化之后，其抗癌效價遠高于先導物芹菜素、氟尿嘧啶，具有一定的研究價值[23]。熊果酸具有誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖、抗腫瘤侵襲等作用。虞燕霞等[24]發現熊果酸可通過上調p53基因，引起下游基因Fas[腫瘤壞死因子(TNF)受體超族，成員6]上調，在上下游基因的聯合作用下使肝癌細胞SMMC-7721凋亡。黃芩素具有阻斷肝癌細胞的細胞周期、誘導肝癌細胞凋亡、抑制肝癌細胞擴散等作用。王方[25]發現黃芩素對人肝癌細胞Hep G2生長具有抑制作用，其機制與增強含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3，8，9的活性，增加丙二醛含量，減弱超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶的活性有關。Yu等[26]發現鼠李秦素可以顯著抑制血管內皮生長因子(VEGF)誘導的VEGFR2磷酸化和下游信號轉導途徑的激活，減輕腫瘤組織中的磷酸化的MAPK、AKT(蛋白激酶B)和STAT3的表達，以達到抗腫瘤血管生成之效。尚未發現有蘇薺苧黃酮抗癌的研究，但Chao等[27]發現蘇薺苧黃酮可明顯抑制脂多糖/γ-干擾素刺激的RAW-264.7巨噬細胞的NF-кB(核因子κB)轉錄活性，顯著降低細胞分泌的TNF-α、IL-6、巨噬細胞炎性蛋白-2和一氧化氮。炎癥被認為是影響癌細胞生長的一個重要因素，因此推測蘇薺苧黃酮抑制NF-кB的轉錄活性，降低癌細胞的增殖和侵襲能力。以上說明JBFB治療肝癌在微觀層次上具有合理性，同時也間接說明網絡藥理學的準確性與合理性。

2.8 JBFB治療PHC的核心通路篩選和分析

通過DAVID平臺對一般靶點進行GO分析和KEGG通路富集，其中基因本體分析涉及的生物過程有450個，細胞組分有38個，分子功能有48個，部分結果如圖 3所示。KEGG通路富集共得到44條，如圖 4所示。同時將Reactome 數據庫(https://reactome.org/)與GO分析和KEGG通路結合分析，實現JBFB治療PHC的活性成分的核心通路的篩選及注釋，Reactome中JBFB治療PHC的生物功能分析，如圖 5所示。

圖 2 熊果酸與TP53、AKT1的分子對接模式Fig.2 Docking mode of ursolic acid with TP53 and AKT1

圖 3 JBFB治療PHC一般靶點的GO分析Fig.3 GO analysis of general targets for JBFB for treatment of PHC

圖 4 JBFB治療PHC一般靶點的KEGG 富集氣泡圖Fig.4 Bubble diagram of KEGG enrichment of general targets for JBFB for treatment of PHC

圖 5 用于治療 PHC 的JBFB活性成分一般靶點的生物功能分析Fig.5 Biological function analysis of general targets for active ingredients of JBFB for treatment of PHC

結合圖 3和圖 5，發現JBFB的作用靶點主要涉及細胞編程性死亡、細胞周期、免疫系統、信號轉導、疾病等多個生物過程；細胞組分主要涉及胞漿、細胞器腔、核質、膜封閉腔、核腔、主軸等方面。分子功能主要涉及酶結合、蛋白激酶活性、ATP結合、激酶結合、DNA結合等方面。圖 4顯示了JBFB作用靶點的Pathway分析結果，124個一般靶點主要分布在癌癥通路、胰腺癌、非小細胞肺癌、前列腺癌、黑色素瘤、慢性粒細胞白血病、大腸癌、膀胱癌、膠質瘤、小細胞肺癌、VEGF信號通路、p53信號通路、MAPK信號通路、JAK-STAT(Janus酪氨酸蛋白激酶-信號傳導和轉錄激活因子)信號通路、Toll樣受體信號通路等多條信號通路中。這體現出JBFB通過調控多個復雜的生物過程、信號通路來治療PHC，且彼此之間存在復雜的相互作用關系。這與中醫治療疾病的整體觀思想不謀而合。

張妮娜等[28]發現半枝蓮可以通過調控VEGF信號通路影響血管內皮細胞增殖、生長、轉移以及血管通透性的增加，抑制血管的生成，進而抑制腫瘤的增殖和轉移。汪雯[29]發現白術內酯類I以濃度依賴于TLR4(Toll樣受體4)/MyD88(髓樣分化蛋白88)下調癌細胞VEGF的表達，其高濃度還可直接抑制癌細胞分泌VEGF。李曉蕓等[30]發現，半枝蓮總黃酮能夠抑制MAPK信號通路中JNK/SAPK(c-Jun氨基末端激酶)的磷酸化水平，并能降低細胞因子IL-6、IL-1β的含量。Yang等[31]發現半枝蓮中提取的野黃芩苷能通過p53信號通路抑制癌細胞增殖，誘導其凋亡。于汝通等[32]發現黃芩素可通過失活JAK/STAT信號通路，抑制癌細胞的遷移侵襲。Li等[33]發現槲皮素可下調HMGB1(高遷移率族蛋白B1)TLR2 TLR4/NF-κB信號傳導途徑減輕四氯化碳所致大鼠肝纖維化。Shi等[34]發現綠原酸通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路改善了由四氯化碳誘導的大鼠肝纖維化。除此之外，還有多條信號通路為癌癥，如胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、大腸癌等，表明JBFB與癌癥相關性較大，而其中半枝蓮廣泛應用于多種癌癥的治療，這說明所得癌癥類通路具有可信性。在腫瘤炎癥環境中，炎性細胞可以釋放化學物質，誘變周圍的癌細胞，加速腫瘤的增殖和轉移[35]，JBFB中的茯苓、白術和半枝蓮均有抗炎療效，推測JBFB通過影響免疫球蛋白的高親和力受體(Fc epsilon RI)信號通路等炎癥通路來改善腫瘤炎癥環境，達到治療肝癌的效果。以上研究間接佐證了所得通路的合理性。說明JBFB通過多條通路治療PHC。

3 結論與討論

運用數據挖掘方法，得出了治療原發性肝癌的藥物頻次、性味歸經和藥物組合模式，從而發現臨床上常采用以甘、辛、苦和性溫的藥為主，從肝、脾、肺和腎等經絡共同論治。在中藥治療原發性肝癌處方配伍上，以補虛，清熱為主，兼顧活血、理氣等，總體用藥規律可歸納為清補結合、虛實兼顧。研究結果表明，臨床用藥遵循“扶正祛邪、標本兼治”的治療原則。

通過網絡藥理學對核心藥物組合JBFB研究，得出了JBFB治療原發性肝癌的核心靶點及信號通路。發現JBFB主要通過細胞凋亡、細胞增殖、血管生成、炎癥等途徑治療原發性肝癌。研究結果表明，JBFB基于多成分、多靶點、多通路治療原發性肝癌，為后續研究提供了科學依據。

有關文獻實驗研究表明[22，36-38]，半枝蓮總黃酮顯著抑制人肝癌細胞Hep3B的增殖，茯苓三萜可誘導Hep G2細胞凋亡，茯苓乙酸乙酯部位顯著抑制Hep G2細胞增殖，白術揮發油能抑制人H22肝癌細胞的增殖、轉移。其中，剔除廣泛信號通路，應重視p53信號通路，實驗研究表明，槲皮素處理人肝癌細胞Hep G2后，可通過p53/mi R-34a/SIRT1通路促進細胞凋亡[21]。熊果酸可通過上調p53基因，引起下游基因Fas上調，在上下游基因的聯合作用下使肝癌細胞SMMC-7721凋亡[24]。野黃芩苷能通過p53信號通路抑制肝癌細胞增殖，誘導其凋亡[31]。以上成分均可作用到p53靶點基因，調控p53信號通路，進而抑制肝癌細胞增殖，誘導其凋亡。上述實驗研究結果，進一步表明了本研究所得到的p53信號通路的可信性。

研究融合數據挖掘與網絡藥理學方法，從整體上分析中藥治療原發性肝癌的用藥規律，若結合疾病證型和用藥劑量，可更加深入地理解中藥治療原發性肝癌的組方規律。針對JBFB中藥物與藥物之間的用藥比例，以探尋最佳用藥比例，將在后續工作中進行研究。

綜上所述，由于中藥成分的多樣性以及中藥與人體的相互作用的復雜性，所以闡述中藥的作用機制仍是一個難題，未能科學揭示中藥分子的作用機制已成為中醫現代化和國際化的瓶頸。融合數據挖掘和網絡藥理學方法，從中醫整體觀的角度分析臨床治療疾病中藥組方規律，并運用網絡藥理學構建“藥物-靶標-疾病”關系，從而分析中藥復方的作用機制，將成為中藥復方作用機制研究的新途徑。