硅膠吸附-交聯脂肪酶的研究

徐 然，韓生華，王利剛

(山西大同大學化學與化工學院，山西大同 037009)

脂肪酶(Lipase) 是重要的生物酶催化劑，也是重要的工業酶制劑，可參與催化含酯基結構物質的水解、合成以及交換等[1]。脂肪酶具有高效催化效率、溫和反應條件、高度特異性以及較少副產物等諸多優點[2]，越來越廣泛地被應用到能源、食品、醫藥以及日化等領域[3]。然而，游離狀態脂肪酶在催化過程中所存在的不穩定性、不能分離與不能再利用等缺點，阻礙了脂肪酶的進一步發展與應用[4]。脂肪酶固定化技術解決了這些不足，正被越來越多的學者所研究[5]。

固定化脂肪酶技術是指采用某種物理或者化學的方法使脂肪酶被限制在專屬的區域內發生催化反應的技術[6]。常用的脂肪酶固定技術大致分為吸附法、包埋法、交聯法和共價結合法[7]。吸附法是由離子鍵、范德華力或者氫鍵等分子間力將脂肪酶吸附到相應載體上，酶分子的活性結構不易被改變，因此能保留較高的活性[8]。但脂肪酶在載體上吸附得不太牢固，在催化使用中容易脫離載體[9-10]。交聯法是指通過脂肪酶與載體或者脂肪酶與脂肪酶的中間形成共價鍵從而交織成一個結實三維網狀結構來進行固定化[11]，交聯法固定的酶穩定性高。一般來說，交聯法都是與其它方法一起使用，如吸附加交聯等，從而形成雙重固定化，使得酶活較高的同時也增加了穩定性[12]。

本文考察了3 種固定方式對脂肪酶固定效果的影響，并對最優固定方式中的關鍵條件進行了優化，以期為脂肪酶今后進一步的應用提供參考。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑與儀器

脂肪酶（酶活力：6.08×104μmol/g，實驗室自制）；硅膠，青島海洋化工有限公司；橄欖油為化學純，無水乙醇、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、50%戊二醛、磷酸二氫鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、聚乙烯醇均為分析純，購自天津康科德有限公司。

DF-101S 集熱式恒溫磁力攪拌器、SHZ-D 循環水式真空泵，常州市國華儀器有限責任公司；HH-2兩孔水浴鍋、KDM 電熱套，南京市桑力設備廠；SB-5200DTDN 超聲清洗機，泰州市力航實驗設備公司；MA200 電子天平，上海志榮科技有限公司；101AB-1電熱鼓風干燥箱，蘇州納美瑞電子有限公司。

1.2 載體處理

稱量硅膠20 g，加入60 mL 的18.5%的鹽酸水溶液，于60 ℃的水浴中回流6 h，之后抽真空過濾。濾得的固體使用去離子水清洗多次直至中性，然后110 ℃條件下干燥12 h，即為活化的硅膠。

1.3 固定方法的選擇

（1）單吸附8 h：稱取活化硅膠0.5 g，分別加入0.1 mol/L 的pH 為7.5 的磷酸緩沖液5 mL，及濃度為3 mg/mL 的脂肪酶溶液5 mL，于室溫下反應8 h 后抽真空過濾，分別收集并測定游離酶、濾液和回收的固定酶的酶活，計算酶活回收率。

（2）吸附6 h后加戊二醛交聯2 h：上述（1）中室溫吸附6 h之后繼續加入適宜濃度的戊二醛攪拌2 h，之后抽真空過濾，分別收集并測定濾液和固定酶的酶活，計算酶活回收率。

（3）吸附交聯8 h：上述（1）中在加入磷酸緩沖液和酶液后直接加入戊二醛交聯劑室溫攪拌8 h，計算酶活回收率。

1.4 脂肪酶活力測定方法

采用橄欖油乳化法測定。酶活：在40 ℃、pH 為8.0磷酸溶液環境中，每克脂肪酶每1 min催化乳化劑所生成的脂肪酸的量（μmol）。

分別取pH 為8.0 的0.1 mol/L 磷酸緩沖液4.0 mL和乳化劑5.0 mL 加入到標簽為樣品a、樣品b 和空白c 3 個瓶子內，于40 ℃保溫5.0 min 后，將1.0 mL 待測酶溶液加入到樣品a、b瓶內催化10.0 min。之后同時向a、b、c 中各加入20.0 mL 無水乙醇終止反應。分別滴加幾滴酚酞，用NaOH 滴定水解出來的脂肪酸，當反應體系變微紅時，記錄反應的NaOH的量。

脂肪酶活力=[ (a+b)÷2-c ]×N×F÷t

式中：a、b—樣品a、b 分別反應的NaOH 體積量，c—空白c 反應的NaOH 體積量，N—NaOH 濃度，F—稀釋倍數，t—時間（min）。

2 結果與討論

2.1 固定方法的選擇

3種方法的固定結果對比見表1。

表1 固定方法的選擇

由表1 可以看出最佳的固定方法為：吸附6 h 后加戊二醛交聯2 h。這種方法是先通過吸附法將脂肪酶吸附固定在已活化的硅膠載體上，進而通過交聯法在吸附了脂肪酶的硅膠外圍進行交聯，即進行雙重的固定，因此具有較好的酶活回收率。僅僅使用吸附法固定后的脂肪酶較不穩固，在反應中較易脫落。而吸附交聯法同時進行，可能又使得脂肪酶分子與分子之間相互纏繞交聯，影響其在硅膠載體上的充分固定。因此選取先吸附再交聯的方式對目標酶進行固定。

2.2 優化脂肪酶的固定條件

2.2.1 優化給酶量

用pH 為7.5的0.1 mol/L 磷酸緩沖液配制濃度分別為1、3、5、7、9 mg/mL 的脂肪酶液，并以此進行給酶量優化。給酶量影響固定反應的結果見圖1。

圖1 給酶量的優化

當體系中加入1 mg/mL 給酶量，此時酶活回收率處于較低值。當體系中加入3 mg/mL 給酶量，酶活回收率達到最高，達19.0%。繼續增大給酶量，酶活回收率顯現降落趨勢?？赡苁且驗榛罨墓枘z載體的量是一定的，其所能固定的脂肪酶的量也是一定的。當固定到載體上的脂肪酶達最大狀態后，再增加脂肪酶則不會提高最終產物的量，反而會因為酶與酶之間發生團聚影響最終固定產物的活性，所以圖中曲線先升后降最后趨近平緩。

2.2.2 優化固定溫度

在3 mg/mL 給酶量下，將反應體系分別放到0、10、20、30、40、50 ℃的水浴中進行固定溫度的優化。溫度影響固定反應的結果如圖2。

圖2 優化固定溫度

隨著固定溫度的增高，酶活回收率也在慢慢增大，當固定溫度控制在30 ℃時，其回收率最高，達28.3%。繼續增高溫度，酶活回收率呈現下降現象。其原因是，脂肪酶的本質是蛋白質，溫度對蛋白質的影響極為重要，溫度過高會使蛋白質活性發生改變，而溫度太低則抑制反應速度。因此過高或者過低的溫度都會影響其最終的回收率。

2.2.3 優化固定時間

在3 mg/mL給酶量以及30 ℃下，選擇1、2、4、6以及8 h進行固定反應中吸附反應時間的優化，見圖3。

圖3 優化吸附時間

吸附反應時間為6 h 時，得到的回收率為34.2%，到達最高。進一步延長吸附時間，酶活回收率表現出下降的結果。吸附反應時間如果太短，脂肪酶分子還未在硅膠載體上徹底吸附。而隨著吸附時間的加長，曲線呈下降趨勢，是因為固定過程中進行的吸附過程主要是靠分子間作用力來完成的，隨著時間的增加吸附在載體上的脂肪酶在不斷攪拌過程中可能會出現脫落的現象，因此脂肪酶的固定量減少了。而且長時間的攪拌也會造成脂肪酶分子的部分失活，酶活回收率也因此降低。

2.2.4 優化固定pH值

在3 mg/mL 給酶量、30 ℃以及吸附6 h 條件下，配制pH 依次是5.5、6.5、7.0、7.5、8.0 以及8.5 的磷酸緩沖液，并以此進行酸堿度的優化，結果見圖4。

圖4 優化固定pH

在pH小于7.5時，增加pH值，其酶活的回收率也會隨之變大。當pH 為7.5 時，酶活回收率最高達40.5%。進一步增大pH 值，則會降低酶活回收率。酸堿環境對該酶的影響極大，pH 值的不同會改變其微觀結構，從而改變酶的特性，過酸或者過堿的環境都能使酶的微觀結構產生變化，這樣就會使脂肪酶發生活性的改變。pH值還可以改變脂肪酶所催化的底物的離解狀態，進而改變脂肪酶與底物的相互接觸和催化作用。因此，酶活回收率在過酸過堿條件下均會顯示出大大降低的結果。

2.2.5 優化戊二醛的濃度

在3 mg/mL 給酶量、30 ℃、吸附6 h 以及pH 值為7.5 的條件下，配制濃度分別為0.05%、0.1%、0.25%、0.5%、1%的戊二醛水溶液，并以此進行戊二醛濃度的優化，結果見圖5。

圖5 優化戊二醛濃度

戊二醛的濃度為0.1%時，酶活回收率測得43%，為最高。當濃度低于0.1%時，由于其濃度太低，提供的固定位點較少，導致交聯效果不好，因此脂肪酶的固定效果不佳。而當其濃度持續增大，酶活回收率卻一直下降，這可能是由于隨著濃度的增大，戊二醛除了會與載體上吸附的脂肪酶交聯還會與反應體系中存在的游離脂肪酶交聯，從而導致脂肪酶在載體上的固定量降低，并且戊二醛是有毒化學試劑，濃度太大會使得脂肪酶變性失活，從而大大影響酶活回收率。

2.3 酶學性質分析

2.3.1 重復使用性

分析游離狀態的脂肪酶與固定后的脂肪酶的重復使用性，結果如圖6。由于游離狀態的脂肪酶分子粒徑太小無法回收，因此無重復使用性。而固定之后的脂肪酶在進行6 次循環使用后，還有45.54 %的初始酶活。

圖6 固定化脂肪酶的重復使用性

2.3.2 室溫保存性

在每天同一時間點分別測定游離狀態和固定狀態的脂肪酶室溫下的酶活力。隨著儲存時間增加，酶活力都會慢慢降低。因此好的儲存穩定性會增加其工業化應用價值。由圖7可以看出，固定狀態的脂肪酶比游離狀態的具有更高的穩定性，10d后仍有33.12%的初始酶活。

圖7 脂肪酶的室溫保存性

3 結論

利用活化處理后的硅膠作載體，實驗室自制脂肪酶（脂肪酶活力：6.08×104μmol/g）為樣品酶，通過3種方法進行脂肪酶的固定，得出先吸附后交聯的方法固定脂肪酶的效果最好。進一步優化固定過程中的各個因素，最后得到其最優固定條件是：給酶量3 mg/mL，固定溫度30 ℃，吸附反應時間6 h，pH 為7.5，戊二醛為0.1%。在該最優條件下所得到的固定酶活回收率為43%。且固定之后的脂肪酶獲得了重復使用性及較好的室溫保存性。將脂肪酶進行固定后，不僅降低了游離脂肪酶的使用成本，而且擴寬了其今后工業化應用的道路。