鐵皮石斛多糖合成相關基因在不同組織及低溫脅迫下的表達分析*

佟巖，黃薈，王輝,2，李樹云，王雨華

(1.植物醫生研發中心，資源植物與生物技術重點實驗室，云南省野生資源植物研發重點實驗室，中國科學院昆明植物研究所，云南 昆明 650201；2.中國科學院大學，北京 100049)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraet et Migo)，屬蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)多年生草本植物[1]。我國民間對鐵皮石斛的應用始于2 000多年前，以新鮮或干燥莖入藥，其干燥莖習稱“鐵皮楓斗”,是我國傳統名貴中藥材[2]。鐵皮石斛富含多糖、生物堿、黃酮類、氨基酸、聯芐類、芪類及其衍生物、酚類化合物、木質素類化合物等次生代謝產物[3]。現代藥理學研究表明鐵皮石斛對腸胃病、心腦血管病、糖尿病、腫瘤等都有一定的療效，同時還具有抗氧化、抗衰老、增強免疫力等功效[4-6]。石斛多糖是鐵皮石斛主要的活性成分和品質決定因子，屬水溶性多糖，結構復雜，是一類由單糖縮合形成的糖苷鍵連接而成的多聚化合物，其含量因品種、發育階段、生長環境等的不同而有差別，水解后產生葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖等單糖，這些單糖通過不同的組合構成石斛多糖除了作為營養物質貯藏外還參與鐵皮石斛生長發育、能量代謝及其應激和防御反應，有著復雜的基因調控網絡[7-11]。20世紀以來，鐵皮石斛益胃生津、滋陰清熱等獨特的藥用價值和廣泛的保健效果被全面開發，鐵皮石斛多糖提取液的測試發現其可以在皮膚上安全使用，同時還擁有良好的保濕效果和清除自由基的能力，顯示鐵皮石斛除傳統藥用價值外在化妝品開發利用中的巨大潛力[12-13]。

野生鐵皮石斛自然分布于安徽西南部、浙江東部、福建西部、廣西西北部、四川、云南東南部[1]。多附生于海拔1 600 m以下溫暖濕潤、空氣暢通的半陰濕地的樹木或巖石上，也生長于開闊暴露陽光直射強烈的巖層峭壁上，有較強的環境適應性[14]。鐵皮石斛對光強的適應性是和其具有特殊的光合代謝途徑有關，鐵皮石斛具有兼性景天酸代謝(crassulacean acid metabolism,CAM)植物的特點，其光合碳代謝途徑隨環境變化可以在CAM途徑和C3途徑間轉換[15]。雖然鐵皮石斛具有較強的抗干旱的能力，但它對冰點以上的低溫極度敏感[16]。鐵皮石斛自然分布區主要在北緯30°以南地區，溫度是其分布、生長發育和產量的重要限制因子，尤其是低溫造成的冷害、凍害，嚴重影響其生存、產量和品質[17]。因此，研究鐵皮石斛的耐寒性具有重要的科學意義和應用價值。通過0 ℃低溫處理20 h的鐵皮石斛葉片與20 ℃對照組的轉錄組和代謝組學聯合分析發現，鐵皮石斛在冷馴化過程通過激活高能量需求的糖水解、氨基酸分解代謝和檸檬酸循環等途徑來提高鐵皮石斛的抗寒性，CBF、MAPKKK16蛋白激酶等諸多基因的表達水平受到顯著影響[18]。可見，植物對低溫脅迫的響應是個復雜的調控過程，包括信號的轉導、逆境響應相關基因表達的啟動以及抗逆相關代謝反應的誘發等。

植物多糖除了能儲存能源之外還是不可或缺的結構單元，其積累依賴于多種單糖的組裝合成，同時這些單糖還可作為信號分子調節植物生長發育中的一系列生理活動[19]。鐵皮石斛多糖的組成和調控非常復雜，目前已對一些重要的基因有所研究，如：蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase,SPS)是調控蔗糖合成的關鍵酶之一，對光合產物的轉運和積累有重要影響，其水解產物及衍生物是石斛多糖重要的組成物質[20]。類纖維素合成酶基因(cellulose synthase-like,Csl)的CslA亞家族基因參與了鐵皮石斛甘露糖的生物合成，并具有重要作用[21-22]。UDP-阿拉伯吡喃糖變位酶(UDP-arabinopyranose mutase,UAM)是一種吡喃糖-呋喃糖變位酶，參與合成細胞壁多糖和糖蛋白，對鐵皮石斛多糖合成尤其是在細胞壁多糖生物合成過程中具有重要作用[23]。UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase，UGPase)是糖代謝中的關鍵酶，催化尿苷三磷酸(uridine triphosphate,UTP)+葡萄糖-1-磷酸(Glc-1-P)?UDP-葡萄糖(UDPG)+焦磷酸(pyrophosphoric acid，PPi)的可逆反應，而UDPG是蔗糖、淀粉、纖維素、半纖維素、糖原及其他寡糖和多糖的葡萄糖基供體，參與多糖類物質的合成代謝[24-25]。在葉片中，UGPase主要參與蔗糖的合成其催化生成的UDPG提供給SPS(蔗糖磷酸合成酶)或SS(蔗糖合成酶)進一步合成蔗糖，此外，UGPase也參與蔗糖的降解、淀粉合成及細胞壁合成等[26]。另外，在對靈芝多糖合成及何首烏的研究中還發現磷酸葡萄糖變位酶(phosphoglucomutase,PGM)作為碳代謝途徑中的一個關鍵的分支酶可催化葡萄糖-6-磷酸(Glc-6-P)和葡萄糖-1-磷酸(Glc-1-P)之間的相互可逆轉化，在UGPG的作用下生成UDP-葡萄糖從而轉化為多糖中的其他單糖組分[27]。UDP-鼠李糖合酶(RHM)則以UDP-Glc為底物連續催化合成UDP-鼠李糖(UDP-Rha)為進一步合成L-鼠李糖及苷提供重要的糖供體，進而構成鼠李糖多糖參與細胞壁的形成，在生長發育過程中發揮重要作用[28]。

本研究選擇了7個在鐵皮石斛及其他藥用植物多糖研究中經驗證參與蔗糖、鼠李糖、淀粉、細胞壁多糖等重要多糖組成物合成途徑中的重要限速酶、合成酶基因。通過這些基因在鐵皮石斛不同組織和低溫脅迫下不同的表達模式，探討多糖合成基因對鐵皮石斛生長發育的調控作用及低溫脅迫對多糖合成基因的影響。為解析低溫對鐵皮石斛多糖合成的影響、鐵皮石斛的抗寒機制及遺傳改良提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及處理

本實驗用鐵皮石斛采自云南省普洱市石斛種植基地栽種的浙江種源。引至中國科學院昆明植物研究所人工氣候室中[晝溫(25±2)℃，夜溫(15±2)℃，光周期為光照12 h/黑暗12 h] 培養4個月，于2020年4月挑選生長良好無病蟲害的一年生植株的成熟的根、莖、葉、花4個組織于-80 ℃液氮中速凍備用。同時選取10盆長勢一致的一年生健康植株，置于低溫(0 ℃)恒溫避光培養箱(Haier)模擬夜間低溫處理，從處理開始的0、4、8、12、16、20和24 h共7個時間點取成熟葉組織于液氮中速凍，-80 ℃保存備用。每個組織或時間點樣品選3株取樣品，處理重復3次。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

參照張志勇等[25]的方法進行改良，使用改良的CTAB-LiCl法提取鐵皮石斛根、莖、葉、花4個組織及低溫脅迫下7個不同時間點葉片樣品的總RNA。使用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix(Tiangen,China)反轉錄試劑盒將各樣品RNA反轉錄合成cDNA，-20 ℃保存備用。

1.3 內參基因篩選

選擇5個鐵皮石斛中常用的內參基因：與蛋白合成和代謝相關的EF-1α和EF-1β、與細胞結構相關的Actin、與核糖體組成相關的18S、以及與糖代謝途徑相關的GAPDH，用于篩選適于本研究的內參基因。各引物序列見表1，引物由擎科生物科技有限公司合成。

表1 鐵皮石斛5個候選內參基因qPCR引物

1.4 qRT-PCR分析基因表達水平

選擇鐵皮石斛多糖合成途徑中7個與蔗糖、鼠李糖、細胞壁等多糖合成相關的基因。從NCBI中搜索鐵皮石斛已有的基因組和轉錄組數據注釋的同源基因序列，用BLAST進行同源序列比對，使用Primer 6.0軟件和Primer-BLAST軟件設計熒光定量PCR引物(表2)。

表2 鐵皮石斛多糖合成相關基因引物信息Tab.2 The related genes primer information of polysaccharide synthesis in D.officinale

以鐵皮石斛根、莖、葉、花4個不同組織和0 ℃低溫脅迫處理7個時間點的cDNA為模板進行PCR。反應體系(9 μL)為2×Taq Maste Mix 4.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 1.5 μL。反應程序為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，72 ℃再延伸5 min，40個循環。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測150 V 20 min。

用Bio-Rad CFX-96(Bio-Rad laboratories,Hercules,CA,USA) 進行qRT-PCR實驗，實驗設置3個重復。反應體系為10 μL：2×SuperReal PreMix Plus(SYBR Green,TIANGEN),cDNA 1 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，1 μL 50×ROX Reference Dye，補充ddH2O至10 μL總體系。

實時熒光定量PCR反應程序 95 ℃預變性 30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，95 ℃延伸10 s，40個循環，70～95 ℃熔解曲線：0.5 ℃,5 s，信號采集。

1.5 數據處理分析

利用Microsoft Excel 2007處理基因的Ct值，使用GraphPad Prism 7作圖。根據篩選出的內參基因，檢測鐵皮石斛多糖合成相關基因在4個不同組織中的表達差異以及低溫脅迫下的表達水平變化模式，表達量計算使用2-ΔΔCT方法。設置不同組織間表達差異以葉片的基因表達量為1，溫度脅迫處理則以0 ℃、 0 h葉片的基因表達量為1進行對比，表達量大于1表示基因上調，表達量小于1表示基因下調。用SPSS 18.0軟件的Student’st-test計算表達差異的顯著性(*P<0.05為顯著，**P<0.01為極顯著)。

2 結果與分析

2.1 RNA檢測與候選內參基因引物特異性分析

對提取的鐵皮石斛根、莖、葉、花4個組織及冷脅迫處理不同時間點葉片的RNA用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示各組織和冷處理RNA的18S和28S條帶完整無拖尾，說明提取的RNA完整性較好。用Nanodrop ND 2000(DE,USA) 檢測RNA的濃度，RNA的A260/A280值在1.9～2.1之間，A260/A230值在2.0～2.3之間，表明RNA的純度高，可用于cDNA合成。

用鐵皮石斛避光0 ℃脅迫0 h的葉片cDNA為模板5個候選內參基因進行PCR，2%瓊脂糖檢測電泳結果(圖1A)顯示GAPDH基因的擴增產物良好，無二聚體，且在鐵皮石斛中具有特異性。進一步以所有樣品cDNA為模板用GAPDH基因進行PCR，產物電泳檢測(圖1B)顯示GAPDH基因可以在低溫脅迫的各時間點均可穩定良好表達，此外，GAPDH內參基因引物的熔解曲線和標準曲線呈現單一峰表明引物特異性較好，結果表明在5個候選內參基因中GAPDH基因是最適合于本實驗的內參基因。

圖1 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物

2.2 7個多糖合成相關基因在鐵皮石斛4個不同組織中的表達差異分析

采用qRT-PCR方法對鐵皮石斛根、莖、葉、花4個不同組織中7個多糖合成相關基因的相對表達量進行分析，結果顯示(圖2)，所有基因在鐵皮石斛不同組織中均有表達，每個基因的表達模式各不相同，但共同表現為在花和根中的表達量均高于在葉片中的表達量。其中，UAM基因在花和根中有高表達，是葉和莖的13～18倍。PGM基因在葉、花、根中的表達量相當，在莖中低表達僅為葉的0.18倍。UGP基因在葉和莖中表達量相當，在花中高表達是葉中的20倍。CSLA4基因在莖和根的表達量均比葉高，在花中表達量更是高達葉中的59倍。RHM1基因在葉和莖中的表達量相當，在花和根中高表達，是葉中的9倍(花中)和3倍(根中)。SPS基因在莖和葉中的表達量相當，花和根中的表達量分別是葉的27倍和9倍。CSLA1基因在花、莖、根中的表達量均比葉中的高，分別是葉中表達量的2倍、3倍和5倍，在根中的表達量最高。

圖2 不同組織中多糖合成相關基因表達量的變化熱圖分析Fig.2 Heatmap of the change of seven genes encoding polysaccharide synthesis in four different tissues

2.3 低溫脅迫下7個鐵皮石斛多糖合成相關基因的表達差異分析

本研究以GAPDH為內參基因，利用qRT-PCR分析7個鐵皮石斛多糖合成相關基因在避光0 ℃低溫脅迫下7個時間點的相對表達水平變化，結果顯示(圖3)，所有基因均表現出在受脅迫后的短時間(4 h)內出現表達量急劇下調呈現先受到抑制的現象，隨著脅迫時間的延長不同基因表現出不同的表達模式。在低溫脅迫的24 h中PGM基因表現出受到持續的顯著抑制作用。UAM基因呈現先下調后上調再下調的波動變化，在20 h時表達量最高為0 h的1.3倍。UGP基因在短時間的下調后在8～20 h期間上升至與0 h相當水平到24 h顯著下調為0 h的0.1倍。CSLA4基因則在12 h時表達量顯著上調為0 h的4.1倍，隨后又逐漸下降。RHM1基因在4～20 h一直處于低表達量水平到24 h上調至0 h的1.7倍。SPS基因在4～20 h之間一直處于被抑制表達到24 h恢復至0 h表達量水平。CSLA1基因在12 h時表達量升高至0 h的2倍，隨脅迫時間增加而降低，至20～24 h表達量均高于0 h。

圖3 低溫脅迫對鐵皮石斛多糖合成途徑相關基因表達的影響Fig.3 qRT-PCR analysis on the expression patterns of genes in polysaccharide synthesis under low temperature treatment

3 討論與結論

實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術目前已廣泛應用于基因表達水平分析研究中，但其結果受RNA質量、引物特異性、內參基因穩定性等多種因素的影響。其中，內參基因的穩定性是qRT-PCR結果準確性和可重復性的保障。雖然科研工作者一直致力于尋找一種或幾種在所有生理狀態下的細胞和樣品類型中均能較穩定地表達的理想內參基因。但遺憾的是近年來的大量研究表明，并沒有表達絕對穩定的基因，任何一種看家基因的所謂恒定表達都只是在一定類型的細胞或實驗因素作用下的穩定，因此，根據不同物種、樣品材料和實驗條件篩選合適的內參基因至關重要。在鐵皮石斛物種中Actin、EF-1α、18S、GAPDH、EF-1β基因在前人的研究中都曾根據自身研究內容而選擇作為內參基因[29-30]。本研究結果表明與糖代謝途徑相關的GAPDH基因在鐵皮石斛根、莖、葉、花4個不同組織及低溫脅迫葉片中表達水平穩定性較高，更適合作為內參基因用于本研究中多糖合成相關基因在鐵皮石斛不同組織中和低溫脅迫處理下基因表達的差異分析。

在鐵皮石斛中，UAM、PGM、UGP、CSLA、RHM和SPS與多糖合成相關的基因在生長發育旺盛的花和根組織中的表達量均高于在成熟的葉和莖組織中的表達量，表明這些基因均參與了鐵皮石斛的生長發育過程。尤其是UGP、CSLA4和SPS基因，其在根和花組織中的表達量分別是葉組織中的20、59、27倍和6、8、10倍，表達量差異揭示這3個基因在鐵皮石斛花和根的生長發育過程中起到了重要的調控作用。CSLA基因參與合成的甘露聚糖是細胞壁的構成和生長發育過程所需的重要物質[21-22]。而UGP和SPS基因參與合成的蔗糖則主要為植物生長發育提供碳架和能量，在許多植物的成花轉變和花器官發育過程中都起著及其重要的作用[31-32]。另外，本研究中的PGM基因經比對鑒定為質體型PGM基因，是參與淀粉合成的關鍵酶基因之一，其在根和花中的表達量與葉中相當，但在莖中表現為顯著低表達。質體型PGM在菠菜(Spinaciaoleracea)[33]和擬南芥(Arabidopsisthaliana)[34]中被發現定位于葉片的葉綠體中，對過渡淀粉的合成至關重要。He等[21]對鐵皮石斛莖中的水溶性多糖組成和淀粉含量的測定發現鐵皮石斛莖中的淀粉含量很少(不到10%)，石斛多糖主要為非淀粉多糖，以水溶性多糖為主。

在低溫處理的24 h中，鐵皮石斛葉片中質體型PGM基因一直呈顯著下調表達，基因表達受到顯著抑制。在高等植物中，磷酸葡萄糖變位酶(PGM)分為質體型PGM(pPGM)和胞質型PGM(cPGM)，分別定位在葉綠體上和細胞質中，其質體型PGM(pPGM)對Glc-1-P的形成至關重要，是淀粉形成的重要酶[34]。低溫處理下鐵皮石斛RHM基因和SPS基因在脅迫前20 h一直呈顯著下調，表達受抑制，直至24 h才上調恢復至與0 h對照表達相當水平。RHM是鼠李糖合成的關鍵酶，并通過糖苷鍵將活化的鼠李糖與小分子連接起來構成鼠李糖多糖參與細胞壁的形成及生長發育過程[35]。蔗糖磷酸合成酶(SPS)的活性反映蔗糖生物合成途徑的能力，與蔗糖的形成呈正相關。已有研究發現SPS基因的表達受光周期調控影響，黑暗處理會抑制SPS基因的表達，而低溫脅迫會上調SPS基因的表達[36-37]。鐵皮石斛葉片UGP、UAM和CSLA基因在脅迫處理下則呈現先下調后上調再下調表達的波動。已有研究表明鐵皮石斛多糖的積累受晝夜溫差變化影響，晝夜溫差10 ℃(25/15 ℃)是最適促進多糖積累的溫度，夜間溫度過低(25/10 ℃)晝夜溫差(15 ℃)大會呈現隨處理時間增加呈先增加后下降的趨勢[38]。而夜間12 ℃可能是薄皮甜瓜(CucumismeloL.)糖代謝發生改變的臨界低溫，到夜間9 ℃則嚴重影響其糖積累及代謝中的相關酶活性[39]。

綜上所述，GAPDH基因可作為內參基因用于鐵皮石斛不同組織及低溫脅迫基因表達水平研究中。7個與多糖合成相關的基因在鐵皮石斛生長發育中也起到一定的調控作用。而夜間0 ℃低溫對鐵皮石斛多糖合成相關基因的表達有顯著的影響。這些研究結果為研究低溫對鐵皮石斛多糖合成的影響、解析鐵皮石斛抗寒機制及其種質資源的改良提供科學依據。