激素信號轉導代謝通路在板栗花粉直感效應中的分析*

王猛，朱秋蓉，李升星，石卓功

(1.西南林業大學 林學院，云南 昆明 650224；2.江西省林業科學院，國家林業局樟樹工程技術研究中心，江西 南昌 330032)

板栗(CastaneamollissimaBL.)是殼斗科(Fagaceae)栗屬(Castanea)植物，果實富含碳水化合物、多酚、維生素、鐵、膳食纖維等。板栗從海拔50～2 800 m均有種植，在我國栽培面積很廣，多數地區采用實生繁殖，也篩選出許多高產的新品種。板栗花期為5—6月，果熟期為9—10月。板栗的雌雄花比例失調，雄花數量遠遠大于雌花的數量，雄花序先于雌花形成。據研究在結果枝上平均1個雌花擁有4.27～8.62條雄花序，每1結果母枝僅有2.44朵雌花[1]。

很多果樹存在直感現象，即雜交種子的胚乳在外在和內在性狀上會表現出父本的遺傳性狀。直感現象對果實或者種子的外在品質，內在品質及其他性狀均有影響。據研究，不同品種的果樹在授粉后，花粉能直接影響其受精形成的種子或果實發生變異[2]。板栗存在直感現象，在接受不同品種的花粉進行授粉后，所形成的種子或者果實會發生變異。在花粉直感對果實外在品質影響的研究中，沙海峰等[3]在對京白梨(Pyrusussuriensis‘Jingbaili’)的研究發現花粉直感對果實重量有顯著影響；李保國等[4]在富士蘋果(Maluspumila)研究中得出花粉直感對果實著色會有影響。在對果實內在品質的研究中，陳慶紅等[5]在金魁獼猴桃(Actinidiachinensisvar.deliciosa‘Jinkui’)果實品質受到花粉直感現象影響中發現，不同獼猴桃品種授粉后果實中可溶性固形物、VC含量均出現明顯的差異;邱燕萍等[6]發現不同授粉品種的桂味荔枝(Litchichinensis‘Guiwei’)在總糖、總酸、葉綠素等含量表現出明顯差異。在其他性狀方面，有研究表明花粉直感效應對櫻桃(Cerasuspseudocerasus)、火龍果(Hylocereusundatus)、藍莓(Sementrigonellae)、扁桃(Amygdaluscommunis)等植物果實的成熟期具有明顯的影響[7-12]。

目前關于花粉直感機理的研究主要有兩個假設，第一個假設認為內源激素合成與花粉直感現象關系密切，種子產生的激素(主要是植物生長素)將負責果實的生長，種子的數量(可能是其質量)與果實大小成正相關[13]；第二個假設主要指出觸發直感效應的信號可能是mRNA[14]。而且，植物內源激素在植物的生長發育中起到重要的作用，在果實性狀中，可以使細胞分裂和增大，在果實中出現明顯果實直感，如成熟度、果實的大小和質量等[15-16]。

板栗的直感現象也非常明顯，實生后代變異類型較多，性狀遺傳有嚴重的分離現象，在一定程度上影響了子代板栗堅果的品質。因此，本研究通過轉錄組測序后，對數據分析，研究植物激素信號代謝在板栗花粉直感中的作用，為將來通過人工栽培技術，有目的的改善果實品質提供理論依據。

1 材料與方法

樣品采集地位于云南省楚雄州永仁縣，嫁接繁殖的9 a生左右的板栗樹品種為永豐1號、永仁早和易門1號。供試材料為板栗不同成熟階段種仁，在成熟前約20 d，每隔11 d采樣一次，采樣的3個時間為：2018/07/26(70 DAP)、2018/08/07(82 DAP)及2018/08/19(94 DAP)，最后1次采樣為球苞開裂的成熟果，共3個時期。

所采板栗種仁當即處理后用液氮速凍后干冰保存送樣進行轉錄組測序，轉錄組測序委托北京諾禾致源科技股份有限公司基于Illumina測序平臺，利用雙末端測序(Paired-End)的方法進行測序，測3個授粉組合同一時期的3組樣品，每個樣品3個生物學重復，共9組轉錄組數據。

1.1 基因差異表達分析

因轉錄與翻譯表達具有時間和空間特異性，在不同組織或生長發育條件下表達水平存在顯著差異的基因，定義為差異表達基因(differential expression gene，DEGs)。使用DESeq2軟件對3個時期不同授粉組合種仁進行分析，篩選閾值為padj<0.05且|log2FoldChange|>1，劃分上調DEG和下調DEG[17]。通過R語言和Origin 8.5繪圖。

1.2 差異基因GO富集分析

GO功能顯著性富集分析給出與基因組背景相比，在差異表達基因中顯著富集的GO功能條目，從而給出差異表達基因與哪些生物學功能顯著相關。該分析首先把所有差異表達基因向Gene Ontology數據庫(http://www.geneontology.org/)的各個term映射，計算每個term的基因數目，然后找出與整個基因組背景相比，在差異表達基因中顯著富集。GO富集分析方法為GOseq[17]，此方法基于Wallenius non-central hyper-geometric distribution。相對于普通的Hyper-geometric distribution，此分布的特點是從某個類別中抽取個體的概率與從某個類別之外抽取一個個體的概率是不同的，這種概率的不同是通過對基因長度的偏好性進行估計得到的，從而能更為準確地計算出GOterm被差異基因富集的概率。

1.3 差異基因KEGG pathway通路分析

在生物體內，不同基因相互協調行使其生物學功能，通過Pathway顯著性富集能確定差異表達基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是有關Pathway的主要公共數據庫[19]。Pathway顯著性富集分析以KEGG pathway為單位，應用超幾何檢驗，找出差異基因相對于所有有注釋的基因顯著富集的pathway。

1.4 qPCR驗證

采用qPCR技術研究板栗種子發育過程中SSS和SS的8個unigenes的表達規律。采用高通量建庫后剩余的RNA樣本，采用天根反轉錄試劑盒合成cDNA第一條鏈。以18sRNA為內參基因，采用EvaGreen染料對篩選出14個淀粉和蔗糖代謝通路中的DEGs進行qPCR驗證分析，qPCR引物采用Primer Premier 5進行設計(表1)，于成都丹鳳科技有限公司進行合成。qPCR條件采用2步法進行：95 °C 酶激活3 min；95 °C變性10 s，58 °C退火和延伸30 s，共40個循環，每次延伸后收集熒光信號；反應結束后于60 °C 逐漸上升至 95 °C的條件下進行溶解曲線分析。試驗設3次重復，熒光定量Ct值于EXCEL 2010中進行整理，樣品的均一化表達量為2-△Ct(樣品△Ct=樣品Ct值-內參Ct值)，以第I時期自交授粉組合的平均表達量為對照，其表達量定義為1個單位，計算不同授粉組合相對表達量ratio，其計算公式為2-△△Ct(△△Ct = 處理組△Ct - 對照組△Ct)[20]。采用SPSS 21對每個對比組合進行單因素方差分析并標出顯著性，使用Origin 8.5軟件繪制基因表達模式的柱狀示意圖。8個unigenes的名稱和引物序列如表1所示。

表1 用于qPCR分析的14對unigenes引物Tab.1 Unigenes and sequence of 14 primer pairs for qPCR analysis

2 結果與分析

2.1 測序數據

轉錄組測序每個樣品至少產生41 212 858 b raw reads，經過測序質量控制，每個樣品至少得到40 019 732 b Clean reads，總共9個測序樣品。各樣品Reads與參考序列比對率最低為59.55%，各樣品Q30堿基百分比均不小于91.1%，每個樣品的GC含量都在44.18%以上(表2)。原始數據已上傳至NCBI數據庫，SRA登入號為：PRJNA540079。

表2 測序數據及組裝結果統計Tab.2 Transcriptome sequencing and assembly results

2.2 差異表達分析

對板栗種仁成熟時各授粉組合對比差異基因進行統計發現，同處于種仁成熟第3時期的授粉組合2和授粉組合1之間差異基因數量最少，差異基因總數為2 192個，其中上調差異基因數為1 125個，下調差異基因數位1 067個；而分別與授粉組合3對比時差異基因數量較多，其中授粉組合3與授粉組合2的差異基因量最多為7 251個，上調差異基因數位3 732個，下調差異基因數位3 519個；授粉組合3與授粉組合1的差異基因數量為6 497個，上調差異基因數位3 438個，下調差異基因數位3 059個(圖1)。綜合得知，在同一時期各授粉組合間差異基因數量差異明顯。

圖1 同一時期各組合對比差異基因Fig.1 Comparison of different genes among different combinations in the same period

2.3 板栗種仁同一成熟期不同組合間差異表達基因的GO注釋

對比組合的GO-term，見圖2，在板栗種仁成熟的第3個時期，分子功能(Molecular_function)中的GO-term條目較多，生物進程(Biological process)中的 GO-term條目較少。而且從圖中可以看出生物進程中主要富集的GO條目為protein phosphorylation(蛋白質磷酸化)，oxidation-reduction process(氧化還原過程)、plant-type cell wall organization(植物型細胞壁組織)、plant-type cell wall organization or biogenesis(植物型細胞壁組織或生物發生)、single-organism metabolic process(單生物代謝過程)、cell recognition(細胞識別)、pollination(授粉)、pollen-pistil interaction(花粉雌蕊相互作用)、recognition of pollen(花粉識別)、response to auxin(生長素的響應)；在分子功能(Molecular_function)中主要富集條目是tetrapyrrole binding(四吡咯結合)、structural constituent of cell wall(細胞壁的結構成分)、kinase activity(激酶活性)、phosphotransferase activity(磷酸轉移酶活性)、protein kinase activity(蛋白激酶活性)、oxidoreductase activity(氧化還原酶活性)、ADP binding(腺苷磷酸結合)、nutrient reservoir activity(養分庫活動)、heme binding(血紅素結合)、phosphorylase activity(磷酸化酶活性)、glycogen phosphorylase activity(糖原磷酸化酶活性)、iron ion binding(鐵離子結合)。

此外，由圖2可知，在板栗成熟的第3個時期，組合2vs組合1和組合3vs組合2，共有的通路為：plant-type cell wall organization(植物型細胞壁組織)、plant-type cell wall organization or biogenesis(植物型細胞壁組織或生物發生)、tetrapyrrole binding(四吡咯結合)、structural constituent of cell wall(細胞壁的結構成分)。組合3vs組合1和組合3vs組合2，共有的通路為nutrient reservoir activity(養分庫活動)、heme binding(血紅素結合)。

圖2 第3時期各授粉組合的GO富集條目Fig.2 Go enriched items of different pollination combinations in the third period

2.4 板栗種仁同一成熟期不同授粉組合間差異基因KEGG pathway通路富集分析

對授粉組合1、授粉組合2和授粉組合3在3個時期的富集在前15的KEGG通路(圖3)進行對比，3個組合共同富集的通路有Protein processing in endoplasmic reticulum(內質網中的蛋白質加工)、Plant-pathogen interaction(植物病原體相互作用)、Starch and sucrose metabolism(淀粉和蔗糖代謝)、Phenylpropanoid biosynthesis(苯丙烷生物合成)、Cysteine and methionine metabolism(半胱氨酸和蛋氨酸的代謝)、Glycolysis / Gluconeogenesis(糖酵解/糖異生)、Plant hormone signal transduction(植物激素信號轉導)、Ribosome(核糖體)、Photosynthesis(光合作用)。

圖3 各授粉組合的KEGG富集通路Fig.3 KEGG enrichment pathway in different pollination combinations

由此可知，不同授粉組合的在同一階段，種仁代謝通路有差異，其中共同富集的通路有內質網中的蛋白質加工、淀粉和蔗糖代謝、植物激素信號轉導等，這表明這些代謝在板栗種仁發育成熟過程中起著非常關鍵的作用。

2.5 花粉直感植物激素代謝通路分析

植物激素信號轉導代謝通路中(圖4)，于同一時期中的各處理組合中皆有差異基因，表明各授粉組合在植物激素信號轉導中存在明顯的花粉直感效應。

圖4 植物激素信號傳導(map 04075)Fig.4 Plant hormones signal transduction(map 04075)

在板栗種仁成熟時期，從板栗種仁轉錄組中鑒定出49個植物激素信號轉導unigenes，編碼22個蛋白家族(表3)。

編碼基因家族中生長素反應蛋白、生長素反應因子、發病相關蛋白1、蛋白磷酸酶2C、生長素反應性GH3基因家族、兩組分響應調節器ARR-A系列 、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、F-box蛋白GID2、生長素流入載體(AUX1 LAX系列)、調節蛋白NPR1的unigenes最多，分別從轉錄組中鑒定出8個、6個、5個、5個、3個、2個、2個、2個、2個、2個。在2vs1對比組合中，生長素反應性GH3基因家族DEGs呈上調趨勢；在3vs1對比組合中，生長素反應蛋白IAA DEGs均為下調；而在3vs1對比組合與3vs2對比組合中均呈下調表達；在3vs1對比組合和3vs2對比組合中，發病相關蛋白1DEGs均下調；在3vs1對比組合和3vs2對比組合中，兩組分響應調節器ARR-A系列DEGs均呈上調趨勢；在3vs1對比組合和3vs2對比組合中，生長素反應因子DEGs均下調；在2vs1對比組合和3vs1對比組合中，蛋白磷酸酶2CDEGs 均上調表達；在3vs1對比組合和3v21對比組合中，生長素流入載體(AUX1 LAX系列)DEGs均呈下調趨勢；在3vs1對比組合和3v21對比組合中，F-box蛋白GID2DEGs均呈下調表達；此外，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶DEGs在這2個對比組合中呈上調趨勢，調節蛋白NPR1DEGs均為下調表達。

綜合得出，在板栗種仁花粉直感發育過程中，影響植物激素代謝的關鍵酶存在于以下蛋白家族中：生長素反應蛋白、生長素反應性GH3基因家族、發病相關蛋白1、兩組分響應調節器ARR-A系列 、生長素反應因子、蛋白磷酸酶2C、、生長素流入載體(AUX1 LAX系列)、F-box蛋白GID2、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[EC:2.7.11.1]、調節蛋白NPR1。

表3 在成熟時期參與了植物激素的代謝途徑所有對比組合的DEGsTab.3 The DEGs of all comparative combinations involved in the metabolic pathways of plant hormones in mature stage

2.6 熒光定量PCR鑒定

為了驗證轉錄組數據的可靠性，根據unigenes序列設計引物，利用qPCR對淀粉和蔗糖代謝通路中5個上調基因和3個下調基因的表達譜進行了評價。這8個DEGs的表達模式與轉錄組數據一致，表明轉錄組分析具有較高的重復性和可靠性(圖5)。

圖5 不同授粉組合淀粉和蔗糖合成酶基因相對表達量Fig.5 Relative expression levels of starch and sucrose genes in different pollination combinations

3 討論與結論

板栗種仁在成熟期第3階段的授粉組合，差異基因表達數量差異顯著。在對差異表達基因的GO分析中，分子功能(Molecular_function)中的GO-term條目較多，生物進程(Biological process)中的 GO-term條目較少。在授粉組合中，組合2 vs組合1和組合3 vs組合2，共有的通路為：plant-type cell wall organization(植物型細胞壁組織)、plant-type cell wall organization or biogenesis(植物型細胞壁組織或生物發生)、tetrapyrrole binding(四吡咯結合)、structural constituent of cell wall(細胞壁的結構成分)。組合3vs組合1和組合3vs組合2，共有的通路為nutrient reservoir activity(養分庫活動)、heme binding(血紅素結合)。

在各授粉組合中，共同富集的代謝通路有內質網中的蛋白質加工、淀粉和蔗糖代謝、植物激素信號轉導等，表明這些代謝在板栗種仁發育成熟過程中起著非常關鍵的作用。

板栗種仁轉錄組中鑒定出49個植物激素信號轉導unigenes，在板栗種仁花粉直感發育過程中，影響植物激素代謝的關鍵酶存在于以下蛋白家族中：生長素反應蛋白、生長素反應性GH3基因家族、發病相關蛋白1、兩組分響應調節器ARR-A系列 、生長素反應因子、蛋白磷酸酶2C、、生長素流入載體(AUX1 LAX系列)、F-box蛋白GID2、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[EC:2.7.11.1]、調節蛋白NPR1。

板栗的花粉直感效應對糖和淀粉具有重要影響[21]。本研究以含糖量高的品種作為授粉樹，所授粉后的果實中的糖含量也相對較高，以早熟品種授粉結出的果實也早實。表明不同品種的板栗受到不同的花粉直感效應的影響。板栗堅果在發育過程中表現出明顯的花粉直感效應。本次研究的KEGG pathway發現參與蔗糖和淀粉代謝的酶主要有關鍵酶：UDP-葡萄糖-1-磷酸酯尿甙基轉移酶、α-1,4-葡聚糖分支酶、淀粉合成酶、蔗糖合成酶和ADP-葡萄糖焦磷酸化酶，這些酶基因對板栗種仁的淀粉合成代謝起調控作用。這與前人研究關于板栗、玉米(Zeamays)、土豆(Solanumtuberosum)、水稻(Oryzasativa)中淀粉合成相關酶報道相一致[22-25]。

在板栗種仁成熟的3個階段，在I-VS-II時期，DEGs主要集中在細胞壁相關的注釋上；I-VS-III時期，DEGs主要集中在各種離子運輸上；II-VS-III時期只有注釋plant-type cell wall與其他時期對比不同，可以推測在淀粉積累時期，這部分基因可能起主導作用。GO注釋和KEGG途徑分析表明，栗子仁成熟期間存在各種代謝關系。在板栗種仁中有差異的主要代謝通路從真核生物的核糖體生物發生和RNA聚合酶逐漸轉變為內吞作用和剪接體這2條代謝通路。除淀粉和蔗糖代謝外，研究中所有比較結果均顯著豐富了RNA轉運、RNA降解、嘧啶代謝、嘌呤代謝、植物激素信號轉導、植物病原體相互作用和甘油磷脂代謝等生物學功能。

綜合得出,不同授粉組合在不同發育時期種仁中淀粉和糖含量在淀粉和蔗糖合成酶、淀粉和蔗糖合成酶基因調控下存在明顯的花粉直感效應。在生產上配置好授粉樹，對栗樹早期高產、提高栗樹品質具有指導意義。