磁性氧化石墨烯基17β-雌二醇分子印跡復合膜的制備與性能

李 穎,雷 蕊,徐文凱,朱小雪,黃艷鳳

(1 天津工業大學 環境科學與工程學院，天津 300387；2 天津工業大學 分離膜與膜過程國家重點實驗室，天津 300387)

內分泌干擾素17β-雌二醇(E2)及其主要代謝物雌三醇(E3)和雌酮(E1)主要通過尿液從人體中以硫酸鹽和葡糖苷酸綴合物排泄出。事實上，一些游離母體化合物經常被發現在污水中或環境水體中，這一問題引起了人們對水生生物和公共健康的關注。這些化合物一旦進入人體，會造成人體生殖功能的發展變化和影響乳腺腫瘤及其他內分泌紊亂等疾病[1-3]。因此，尋找一種快速高效的方法來吸附去除E2具有重要的意義。

分子印跡技術(molecular imprinting technique，MIT)是一種新型的多功能識別材料制備技術，其核心是制備分子印跡聚合物(molecular imprinted polymer，MIP)。它們不僅具有與抗體相當的特異性識別能力[4]，而且具有成本低，制備容易，機械/化學穩定性好，可重復使用性好等優點[5-9]，已經廣泛應用于純化和分離，化學、生物傳感器，藥物輸送等領域[10-15]。然而，分子印跡仍面臨一定的挑戰，基于廣泛的粒度分布和大面積較深的結合位點，導致特異性結合位點較少和阻礙了模板的重新綁定。為了解決這個問題，引入可逆加成-斷裂鏈轉移(reversible addition fragmentation chain transfer，RAFT)聚合技術。RAFT技術可以在MIP表面上或接近表面的地方直接產生氫鍵的結合位點，提高了大分子的可及性，因此可在固體載體的表面上制備具有高接枝密度和納米厚度的MIP薄膜[16-17]。Shao等[18]利用RAFT技術制備了新型核-殼磁性四溴雙酚A的分子印跡材料，實現了對有機污染物四溴雙酚A的快速富集與分離。Hu等[19]利用RAFT技術制備了分子印跡聚合物涂層硅固相萃取纖維，實現了對辣椒樣品中蘇丹染料的快速靈敏檢測。Lee等[20]利用RAFT技術在碳納米管表面接枝茶堿印跡聚合物，實現了其對茶堿的特異性結合從而進行監測。張毅等[21]利用RAFT技術制備了分子印跡微球，實現了對恩若沙星及其類似物的特異性吸附，由此可見RAFT聚合在分子印跡領域發揮著重要作用。氧化石墨烯(graphene oxidized，GO)具有超高的比表面積且表面含有大量含氧官能團，已經成為生長金屬和金屬氧化物納米粒子的最理想的底物之一，并在使用過程中繼續保持這些納米粒子的穩定性。Fe3O4由于其特有的磁性能被廣泛地應用于各種領域，如靶向藥物遞送，生物成像和傳感器[22-25]。但因Fe3O4在空氣中容易氧化和高度聚集等問題而常與石墨烯、金屬納米粒子以及導電聚合物等材料雜交[26-27]。

本實驗首先通過水熱法將Fe3O4負載到片層氧化石墨烯表面形成GO@Fe3O4復合材料，再利用RAFT分子印跡技術，以GO@Fe3O4為載體，17β-雌二醇為模板分子，通過甲基丙烯酸和二乙烯基苯的接枝共聚作用制備磁性氧化石墨烯基17β-雌二醇分子印跡復合膜(GO@Fe3O4-MIP)，實現對水環境中17β-雌二醇分子的快速檢測。

1 實驗材料與方法

1.1 主要原料

石墨粉，Alfa Aesar公司；濃硫酸(98%)、高錳酸鉀(KMnO4)、氯酸鈉(NaClO3)、無水乙醇、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，天津風船化學試劑有限公司；氫氧化鈉(NaOH)、三氯化鐵(FeCl3·6H2O)，天津市北方天醫化學試劑廠；三乙胺、四氫呋喃(THF)、苯基溴化鎂(PMB)、二硫化碳(CS2)，百靈威化學技術有限公司；甲基丙烯酸(MAA)，二乙烯基苯(DVB)、偶氮二異丁腈，天津市光復精細化工研究所；氯化亞砜，天津市科密歐化學試劑有限公司；苯，阿拉丁試劑有限公司。

1.2 GO@Fe3O4-MIP的制備

1.2.1 GO@Fe3O4的制備

根據參考文獻[28]制備GO。其次取1 g GO于1000 mL二次水中，加入5 g NaOH和5 g NaClO3，超聲2 h后靜置沉淀，用乙醇清洗4次，真空干燥后獲得羧基化的GO(GO-COOH)。將0.8 g GO-COOH，超聲分散到50 mL氯化亞砜和25 mL苯的混合體系中，在N2保護下70 ℃回流反應24 h，反應產物依次用THF、乙醇各清洗3次后真空干燥，成功制備酰氯化氧化石墨烯(GO-COCl)。

采用文獻[27]的合成方法制備了粒徑小于3 nm的羧酸功能化四氧化三鐵微球(Fe3O4-COOH)。取0.5 g GO-COCl，超聲分散到50 mL DMF中，通氮除氧10 min后，加入20 mL(15 mg/mL)的Fe3O4-COOH水相磁流體和2 mL三乙胺。在50 ℃下反應24 h，外加磁場作用收集產物，產物依次用DMF、乙醇各洗滌3次后，60 ℃下真空干燥，得到磁性氧化石墨烯(GO@Fe3O4)。

1.2.2 GO@Fe3O4-RAFT的制備

GO@Fe3O4-RAFT的制備根據文獻[29-30]。0.3 g GO@Fe3O4與5 mL溴代異丁酯溶解于1 mL三乙胺和40 mL甲苯的混合體系中，通N2除O215 min，100 ℃下回流反應24 h后，磁分離收集產物。產物分別經過甲苯、乙醇和乙醚各清洗4次后真空狀態下干燥獲得溴代化磁性氧化石墨烯(GO@Fe3O4-Br)。

將4 mL的PMB溶解在50 mL的THF中，向混合液中添加2 mL的CS2，在40 ℃油浴中反應2 h后加入0.2 g GO@Fe3O4-Br，通N2除O215 min后，反應體系在密封狀態下繼續反應24 h。產物分別用二次水、THF、乙醇清洗3次。真空干燥獲得RAFT鏈轉移劑(二硫代異丁酸酯)修飾的磁性氧化石墨烯(GO@Fe3O4-RAFT)。

1.2.3 GO@Fe3O4-MIP的制備

分別取100 mg GO@Fe3O4-RAFT，25 mL乙腈，0.136 mg E2，0.30 mL MAA，1.42 mL DVB，25 mg偶氮二異丁腈溶解于三口燒瓶中，通N2除O215 min后，轉移至置恒溫水浴鍋，反應體系在密封狀態下反應24 h后，產物用乙腈、乙醇各洗滌3遍，然后用冰乙酸∶乙醇=1∶4的混合溶液索式提取E2，真空干燥得到GO@Fe3O4-MIP。磁性石墨烯非分子印跡膜(GO@Fe3O4-NIP)的制備方法與GO@Fe3O4-MIP相同，只是制備過程中不加入模板E2。

1.3 樣品的表征

用D8 DISCOVER X射線衍射儀(XRD)分析晶體結構，用H7650透射電子顯微鏡(TEM)進行納米粉體形貌、顆粒尺寸及分布分析，用Agilent-S5500原子力顯微鏡(AFM)測定樣品中的厚度，用S-4800 APOLLO XL特征X射線能譜儀(EDS)測定樣品的元素分布。

1.4 GO@Fe3O4-MIP對17β-雌二醇的吸附實驗

1.4.1 GO@Fe3O4-MIP的吸附效率-時間曲線

在室溫下，將5 mg的GO@Fe3O4-MIP與GO@Fe3O4-NIP分別放入到含有10 mL 0.06 mmol/L的E2水溶液的離心管中，放置在回旋式振蕩器上振蕩。

在此過程中，經歷不同時間后，將樣品分別分離出來，利用紫外光譜儀測試不同吸附時間后溶液中E2的含量，根據式(1)計算GO@Fe3O4-MIP和GO@Fe3O4-NIP在不同時間內的吸附效率，繪制出GO@Fe3O4-MIP和GO@Fe3O4-NIP的吸附效率-時間曲線。

Q=[(C0-Ce)/C0]×100%

(1)

式中：Q為吸附率，%；C0為吸附前樣品濃度，即0.06 mmol/L；Ce為吸附后樣品濃度，mmol/L。

1.4.2 GO@Fe3O4-MIP的吸附等溫曲線

室溫下，將5 mg的GO@Fe3O4-MIP和GO@Fe3O4-NIP分別放入到10 mL含有不同濃度的E2水溶液的離心管中，放置在回旋式振蕩器上振蕩12 h后，在外磁場作用下分離樣品。利用紫外光譜儀測試吸附后溶液中E2的含量，根據式(2)計算出GO@Fe3O4-MIP和GO@Fe3O4-NIP兩種復合材料在不同濃度時的吸附量，繪制出GO@Fe3O4-MIP和GO@Fe3O4-NIP兩種復合材料隨濃度變化的吸附等溫線。通過Langmuir線性擬合計算出GO@Fe3O4-MIP和GO@Fe3O4-NIP對E2的最大飽和吸附量。

Qeq=(C0-Ce)V/m

(2)

式中：Qeq為吸附量，mg/g；V為樣品體積，10 mL;m為吸附劑質量，g。

1.4.3 GO@Fe3O4-MIP的吸附選擇性

室溫下，將5 mg的GO@Fe3O4-MIP和GO@Fe3O4-NIP分別放入到10 mL 0.06 mmol/L的E2、E3、E1、雙酚A 4種不同物質水溶液離心管中，放置在回旋式振蕩器上振蕩12 h后，在外磁場作用下分離樣品。用紫外光譜儀分別測定吸附后4種水溶液中的上述4種物質的含量，根據式(1)計算出兩種復合物對4種物質的吸附效率，分析GO@Fe3O4-MIP對E2的吸附選擇性。

2 結果與分析

2.1 樣品的晶體結構

圖1為GO@Fe3O4和GO@Fe3O4-MIP的X射線衍射譜圖，2θ在10°～80°范圍內進行掃描。從GO@ Fe3O4的XRD圖中可以看到，在2θ=30.23°，35.58°，43.22°，57.15°，62.91°處出現Fe3O4晶體結構的特征衍射峰。GO@Fe3O4-MIP的XRD圖與GO@Fe3O4的XRD圖相互對比分析，依然含有Fe3O4晶體結構的特征衍射峰，這說明在GO@Fe3O4表面上形成的MIP膜并未影響Fe3O4的晶體結構，只是峰強減弱，峰寬變寬。此外，在2θ為18.16°附近，GO@Fe3O4和GO@Fe3O4-MIP的XRD圖中均出現了GO的特征衍射峰。

圖1 GO@Fe3O4，GO@Fe3O4-MIP的XRD圖譜Fig.1 XRD patterns of GO@Fe3O4 and GO@Fe3O4-MIP

2.2 樣品的形貌

圖2為Fe3O4-COOH，GO，GO@Fe3O4和GO@Fe3O4-MIP的高倍透射電鏡照片。從圖2中可以看到，利用FeCl3·6H2O在高溫下熱解生成Fe3O4，生成的Fe3O4再被聚丙烯酸交聯包裹，制備的Fe3O4-COOH納米粒子為均勻的球形結構，粒徑平均在2～3 nm之間，同時，Fe3O4-COOH磁性納米粒子表面的羧酸基團之間存在靜電排斥作用，使其避免了磁性納米顆粒之間的磁性團聚作用，可以在介質中均勻分散。GO片的厚度非常薄、表面平滑，有部分褶皺和重疊現象，但褶皺和重疊部分依然具有很好的透光率。從GO@Fe3O4的高透射電鏡照片中可以清楚地看到，透光率高的、接近透明的載體為氧化石墨烯片，氧化石墨烯載體上面分散著的透光率低的黑色納米顆粒為Fe3O4-COOH。通過Fe3O4-COOH表面的羧酸功能基團與酰氯化石墨烯結構中酰氯基團之間的酰氯化反應，將粒徑均一的Fe3O4負載到GO上，使GO磁性功能化。GO@Fe3O4表面接枝分子印跡膜后，其表面結構發生了明顯變化，可以清楚地看到GO@Fe3O4表面平鋪了一層透光率低的黑色薄膜，此黑色薄膜使GO@Fe3O4-MIP表面變得平滑，也幾乎沒有透光性。

圖2 Fe3O4-COOH(a),GO(b),GO@Fe3O4(c)和GO@Fe3O4-MIP(d)的TEM圖Fig.2 TEM images of Fe3O4-COOH(a),GO(b),GO@Fe3O4(c) and GO@Fe3O4-MIP(d)

2.3 樣品的厚度

原子力顯微鏡能夠對物質進行表征分析，觀察目標物質的形態結構，圖3為GO和GO@Fe3O4-MIP的AFM圖。圖上顯示GO表面均勻平滑，平均厚度約為1.21 nm。GO@Fe3O4-MIP的AFM圖上顯示MIP接到GO@Fe3O4上，使GO@Fe3O4-MIP表面薄厚不均，凹凸不平，平均厚度約為6.45 nm。根據AFM測試結果可以計算出GO@Fe3O4-MIP上的17β-雌二醇分子印跡膜的厚度約為5.24 nm。

圖3 GO(a)和GO@Fe3O4-MIP(b)的AFM圖Fig.3 AFM images of GO(a) and GO@Fe3O4-MIP(b)

2.4 EDS能譜分析

圖4為GO@Fe3O4-MIP制備過程的EDS能譜圖。從圖中可以看到GO-COOH的譜圖中含有C，O，Na 3種元素，C，O含量相對較高，Na元素來自反應中的氯酸鈉和氫氧化鈉。GO-COCl與GO-COOH的譜圖相比，圖中增加了Cl元素，Cl元素來自酰氯化反應的氯化亞砜，Cl元素的出現說明酰氯化反應成功合成了GO-COCl。GO@Fe3O4與GO-COCl的譜圖相比，圖中Cl元素消失，Fe元素出現，此結果說明通過Fe3O4-COOH表面的羧酸官能團與GO-COCl表面的酰氯基團之間的酰氯化反應，將粒徑均勻的Fe3O4-COOH微球成功地負載到GO表面。此外，GO@Fe3O4-MIP復合膜的EDS能譜中出現了S元素，S元素來自于GO@Fe3O4-RAFT結構中的RAFT試劑(二硫代異丁酸酯)，S元素的出現證明了RAFT試劑成功接枝到了GO@Fe3O4表面，并由RAFT試劑控制分子印跡體系的自由基聚合反應，在GO@Fe3O4表面平鋪一層17β-雌二醇分子印跡聚合物膜。

圖4 GO-COOH(a),GO-COCl(b),GO@Fe3O4(c) and GO@Fe3O4-MIP(d)的EDS能譜圖Fig.4 EDS spectra of GO-COOH(a),GO-COCl(b),GO@Fe3O4(c) and GO@Fe3O4-MIP(d)

2.5 振動樣品磁強計(VSM)對樣品的磁性能分析

Fe3O4-COOH，GO@Fe3O4，GO@Fe3O4-MIP的磁性能利用VSM分析如圖5所示。從圖中可以看到Fe3O4-COOH磁化強度為62.91 A·m2·kg-1；GO@Fe3O4的磁化強度為35.15 A·m2·kg-1;GO@ Fe3O4-MIP的磁場感應性由于表面MIP膜的存在，與GO@Fe3O4相比有所降低，磁強度為12.89 A·m2·kg-1，但仍可利用外加磁場從介質中快速有效地分離出來并重復利用。

圖5 Fe3O4-COOH，GO@Fe3O4，GO@Fe3O4-MIP的磁滯回線(插圖：利用磁鐵將GO@Fe3O4-MIP從介質中分離)Fig.5 VSM curves of Fe3O4-COOH，GO@Fe3O4，GO@Fe3O4-MIP (illustration:GO@Fe3O4-MIP was separated from the media using a magnet)

2.6 樣品的吸附性能分析

2.6.1 吸附效率-時間曲線

圖6為GO@Fe3O4-MIP和GO@Fe3O4-NIP的吸附效率-時間曲線,從圖6中可以看到，開始吸附的15 min內，GO@Fe3O4-MIP對E2的吸附效率明顯加快，隨著時間的延長，吸附效率的增幅逐漸減慢，到30 min后吸附效率逐漸趨于平衡，GO@Fe3O4-MIP對E2的最大吸附量接近80%，說明GO@Fe3O4-MIP對E2吸附效果顯著。在同等條件下GO@Fe3O4-MIP對E2的吸附效率大大高于GO@Fe3O4-NIP。這是因為E2的結構在印跡聚合反應中被“凍結”在GO@Fe3O4-MIP表面的分子印跡聚合物膜中，當洗脫除去E2后，聚合物膜中殘留了與其形狀相吻合的空穴，其內分布著剛好與E2相匹配的氫鍵結合位點，能夠對E2進行特異性分子識別。而GO@Fe3O4-NIP表面沒有形成有效的氫鍵結合位點，對E2的吸附只是非特異性吸附。

圖6 GO@Fe3O4-MIP和GO@Fe3O4-NIP的吸附效率-時間曲線Fig.6 Adsorption efficiency-time curves of GO@Fe3O4-MIP and GO@Fe3O4-NIP

2.6.2 吸附等溫曲線

圖7為GO@Fe3O4-MIP和GO@Fe3O4-NIP的吸附等溫線，從圖7中可以看到，在0.01～0.06 mmol/L的E2濃度范圍內，GO@Fe3O4-MIP的吸附量隨E2濃度升高而不斷增加，當其濃度超過0.06 mmol/L以后，GO@Fe3O4-MIP的吸附量逐漸趨于平衡。在0.01～0.2 mmol/L整個濃度范圍，GO@Fe3O4-MIP的吸附量隨E2濃度的變化值明顯高于GO@Fe3O4-NIP，這表明GO@Fe3O4-MIP對目標分子E2有很強的分子識別能力。這一現象可以通過GO@Fe3O4-MIP聚合過程及表面結構進行分析：GO@Fe3O4表面接枝了大量的RAFT試劑，RAFT試劑有效地控制了E2，MAA，DVB在GO@Fe3O4表面所進行的自由基聚合反應，使GO@Fe3O4表面平鋪了一層MIP膜。因為聚合過程中是以E2為目標分子，在GO@Fe3O4-MIP復合膜表面形成了與E2大小適宜的孔狀結構，其中氫鍵鍵合位點可以與E2進行專一性表面識別結合，其最大吸附量能達到28.62 mg/g。然而，GO@Fe3O4-NIP的聚合過程中，缺少目標分子E2，GO@Fe3O4-NIP表面不存在有效印跡位點，與E2的氫鍵鍵合作用較弱，不能選擇性地與E2進行鍵合，吸附作用類型屬于非特異性吸附，它的最大吸附量為9.63 mg/g。

圖7 GO@Fe3O4-MIP和GO@Fe3O4-NIP的吸附等溫線Fig.7 Adsorption isotherm of GO@Fe3O4-MIP and GO@Fe3O4-NIP

2.6.3 吸附選擇性

從圖8中看出GO@Fe3O4-MIP復合膜對E2的選擇性吸附率明顯高于E3,E1,雙酚A(BPA)3種競爭分子。同樣條件下，對E3，E1，BPA3種競爭分子的吸附效率則相差無幾，分別為36.27%，25.83%，22.94%。而GO@Fe3O4-NIP復合膜對4種物質的吸附效率明顯低于GO@Fe3O4-MIP復合膜，對4種物質的吸附率相差不大。此結果進一步驗證了GO@Fe3O4-MIP復合膜對于E2具有特異性分子識別能力。

圖8 GO@Fe3O4-MIP和GO@Fe3O4-NIP的吸附選擇性Fig.8 Adsorption selectivity of GO@Fe3O4-MIP and GO@Fe3O4-NIP

3 結論

(1)選擇GO@Fe3O4為載體，E2為模板分子，采用RAFT分子印跡聚合法成功制備了GO@Fe3O4-MIP復合膜，并研究了GO@Fe3O4-MIP對E2的吸附性能。

(2)GO@Fe3O4-MIP在開始吸附的15 min內對E2的吸附效率明顯加快，到30 min后吸附效率逐漸趨于平衡，最大吸附量接近80%，通過Langmuir線性擬合計算出最大飽和吸附量為28.62 mg/g。

(3)0.01～0.2 mmol/L整個濃度范圍內，GO@Fe3O4-MIP對E2的飽和吸附濃度為0.06 mmol/L；吸附選擇性性能實驗表明GO@Fe3O4-MIP對E2具有專一的特異性識別能力。說明GO@Fe3O4-MIP在復雜水體環境中能快速有效地實時檢測E2。