復水干土的無機氮組分及對鮮土檢測的可替代性

李仰征， 李 蘭， 柯西祥， 趙曼昀， 賀 茂， 雷興慶， 殷 健

(貴州工程應用技術學院 生態工程學院， 貴州 畢節 551700)

0 引言

【研究意義】氮素是植物生長的重要影響元素之一。無機氮雖然在土壤全氮中占比較低，但其是植物直接利用氮的主要形式，因此在土壤研究領域受到廣泛關注。由于野外采樣和室內檢測的復雜性，往往導致使用新鮮土樣進行檢測的要求無法得到保障，以致風干土樣作為一種便捷的預處理模式被國內外學者所廣泛采納[1-4]?！厩叭搜芯窟M展】與鮮土相比，風干過程會導致有機物質礦質化加速，致使無機氮含量不同程度地提高[5-7]。風干過程最直接的表現是土壤水分的損耗，使得氮的轉化與平衡受到干擾。因此，復水過程能否消除干土效應、恢復原有土壤生境并用于后續其他研究值得關注。國外的研究起步較早且主要集中在土壤微生物領域。BIRCH[8]研究發現，復水培養后，土壤呼吸作用明顯增強。PLACELLA等[9]研究發現，復水干土前后氨氧化微生物種群結構并未發生明顯變化。國內也有零星報導，沈其榮等[3]開展了復水干土過程對無機氮的影響研究工作；周雪等[10-11]比較了復水干土過程對土壤微生物增殖的影響。鮑俊丹等[12-13]發現，土壤亞硝態氮含量與氮肥施用量和水分含量均呈直線正相關，且相關性達顯著水平?！狙芯壳腥朦c】總體而言，有關復水干土過程對土壤無機氮影響方面的研究偏少且風干時長隨意性較大，涉及的無機氮指標也不全面，亞硝態氮往往被忽略。雖然亞硝態氮是硝化作用的過渡產物，但可通過植物根系吸收或淋溶進入其他環境介質，進而可能產生更深遠的生態風險。綜上，復水干土過程不同時段無機氮組分的變化規律目前仍未見專題報導，干土過程中的土壤能否替代新鮮土壤進行相關形態氮的檢測工作仍無明確論斷。因此，專題研究復水干土過程對土壤各無機氮組分的時間序列影響，在豐富土壤氮素循環理論和改進檢測手段等方面具有重要意義?！緮M解決的關鍵問題】以畢節市七星關區林下鮮土及復水風干土為研究對象，通過檢測分析土壤全氮、銨態氮、亞硝態氮與硝態氮等指標，研究復水干土過程對林下土壤無機氮組分的影響，進而確定鮮土無機氮的可替代性時間節點等，旨在為改進土壤氮素檢測手段提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

畢節市七星關區位于貴州省西北部，為滇東高原向黔中山原過渡地帶，海拔1 400～1 500 m，年均溫與降雨量分別為12.8℃和900 mm。地表出露巖石以二疊紀和三疊紀的沉積灰巖為主，屬亞熱帶高原季風氣候，巖溶地貌發育充分。在城市郊區選擇植被郁閉度差異明顯的景觀林地3個，分別對應《土地利用現狀分類》(GB/T 21010—2017)中的喬木林地、灌木林地和其他林地3種土地類型。3個樣地環境條件如表1所示。樣地空間間距0.5～1 km，以保證母質和氣候等成土因素較為接近。

表1 樣點地理坐標、環境條件及土壤理化性質

1.2 材料

1.2.1 土樣 于2019年8月梅花布點采集表層鮮土，去除雜物四分法保留土樣備用。

1.2.2 試劑 相關化學藥品純度級別均為分析純或化學純，實驗用水為二次蒸餾水。

1.3 方法

1.3.1 土樣預處理 24 h內檢測鮮土全氮、銨態氮、亞硝態氮、硝態氮和脲酶活性等指標。取過2 mm篩的自然風干土樣測定其酸堿度、有機質、全磷、速效磷、速效氮等指標。復水干土過程是將盛有飽和硫酸鉀溶液的燒杯置于玻璃質容器底部，再平鋪風干土于燒杯周邊并用凡士林密閉玻璃容器，整個過程為厭氣環境，10 d后每天測定其土壤含水率，直至其數據基本恒定不再增長即代表復水過程結束，此時土壤吸濕水含量達最大，隨即取出復水后土壤置于室溫下好氣環境再次自然風干。

1.3.2 復水干土過程土壤相關氮含量檢測 于風干過程第1天(9月16號)、第3天、第5天、第7天、第10天、第15天、第20天、第25天、第30天、第40天、第55天、第70天和第85天檢測其土壤相關氮含量。分別采用重鉻酸鉀外加熱法、鉬銻抗比色法、酸溶比色法、靛酚藍比色法、N-(1-萘基)-乙二胺光度法、酚二磺酸光度法、堿解擴散法及氨釋放量法測定土壤有機質、速效磷、全磷、銨態氮、亞硝態氮、硝態氮、速效氮及脲酶活性等指標[14]，3次平行。各指標計算時均以扣除水分的干土計量。為研究土壤含水率和環境溫度對土壤相關氮含量的影響，同時采用烘干法測當天土壤含水率和記錄氣溫均值。

1.3.3 干土過程對鮮土無機氮檢測的可替代性 干土不同時段無機氮含量變化顯著[11]，因此，為比較不同復水干土各時段土壤與新鮮土無機氮含量的差異，將數據作歸一化處理：以銨態氮為例，某風干時間節點各樣地銨態氮含量除以各自新鮮土銨態氮含量，得到無量綱的比值R。然后計算3個土樣此時間節點R的標準差N，如N值為整個干土過程的最小值，說明該時間節點的干土與新鮮土壤的銨態氮含量最為接近。為對3種無機氮作出統一評判而引入綜合可替代性指數M，其為3種無機氮在某時刻標準差N的算術平均值。

1.4 數據統計與分析

數據采用Excel 2003和SPSS 17.0進行處理分析，采用CorelDRAW 12進行作圖。

2 結果與分析

2.1 復水干土過程土壤全氮含量變化

從圖1看出，全氮含量在干土過程中并不穩定。3個土樣在風干早期均表現出上升態勢。其中，苗圃園地和次生喬林地在第15天出現明顯峰值，全氮含量分別為1 112.41 mg/kg和1 322.56 mg/kg，為各自干土第1天含量的1.44倍和1.50倍，峰值效果明顯。之后出現不同程度的下降態勢并逐漸趨于穩定。第85天時3個樣地全氮均值與新鮮土壤含量(圖1中虛線縱軸右側所示)相差較小，比率均值為95.56%。對3個樣地土壤全氮均值與干土天數的方差分析也表明，第15天時全氮含量與第3天、第5天、第7天、第10天和第20天時無顯著差異，而與其他時段差異達顯著水平。

圖1 復水干土過程土壤全氮變化曲線

2.2 復水干土過程土壤無機氮含量及環境條件變化

從圖2看出，整個干土過程無機態氮含量的變化存在較大差異。最大的為銨態氮，含量為18.79 mg/kg，占無機氮的85.44%；其次是硝態氮，為3.11 mg/kg；亞硝態氮含量最低，為0.10 mg/kg，占比僅0.52%。與大多數土壤無機氮的研究報導結果是一致的，證實了亞硝態氮只是中間過渡產物含量有限的結論。干土第1天土壤銨態氮含量為最大，之后下降并穩定，第40天以后與鮮土含量(圖2中虛線縱軸右側所示)基本持平。根據干土過程不同時段無機氮含量的特點，可將整個過程大致劃分為干土早期(1～10 d)、中期(10～40 d)和后期(40 d以后)共3個時段。干土早期銨態氮含量遞減速率顯著大于中期和后期，3個樣地氨氧化速率(AR)均值為4.41 mg/(kg·d)，與蘇瑜等[15]的研究結果3.22 mg/(kg·d)較為接近，且銨態氮在干土早期結束時含量已趨穩。亞硝態氮和硝態氮也有類似情況，但其時間略有提前，均在第5天或第7天以后曲線已基本平穩(硝態氮的次生喬林地例外)。表明，干土早期階段是復水后土壤氮素平衡的調整期，之后各無機氮含量理應穩定少變。但亞硝態氮與其他形態無機氮相比，其曲線并沒有穩定地保持到整個干土過程結束。第30天后出現明顯的上升態勢，硝態氮的2個樣地也在第70天出現明顯波動。以苗圃園地為例，第70天其硝態氮含量為2.40 mg/kg，而其前后的第55天和第85天分別僅為0.84 mg/kg和0.86 mg/kg，峰值特點顯著。整個干土過程3個土樣含水率均出現明顯變化，總體表現為干土過程早期土壤含水率逐步下降，干土中期趨于平穩，而干土后期由于受到大氣溫度影響土壤含水率又出現波動。

圖2 復水干土過程土壤無機氮含量及土壤水分與大氣溫度曲線

2.3 干土過程對鮮土無機氮檢測的可替代性

從圖3看出，銨態氮在干土中期以后(40 d)與新鮮土壤含量最為接近，直至干土過程結束其標準差變化都較小。硝態氮則在整個干土過程中變化均不顯著；在第30天與新鮮土含量最為接近，標準差為0.23。亞硝態氮在干土第1天和干土后期與鮮土差異最大。由此可見，干土過程各無機氮的替代性時間節點并無明顯聯系及規律所循。鑒于干土過程各無機氮的替代性時間節點關聯性不強，為作出統一評判故而引入綜合可替代性指數M進行評價。在第40天時M值僅為0.20，且該時間節點以后土壤全氮已經穩定。40 d以后的硝態氮與亞硝態氮波動導致該值出現起伏(在第55天較為明顯)。如果整個干土過程大氣環境相對恒定，無論后續干土時長有多久，土壤氮素循環應接近平衡狀態。因此，大氣環境穩定條件下40 d以后可以作為復水干土替代新鮮土進行無機氮檢測的時間節點。

圖3 復水干土過程土壤無機氮標準差及可替代性指數分布

3 討論

土壤全氮主要源于成土母質中的礦物風化、動植物殘體返還、人為施加、大氣沉降和微生物固氮等途徑。被采集時生物返還和大氣沉降就即刻終止，礦物的風化速率又極為緩慢，短時間內不可能有礦物晶體分解對土壤全氮產生影響。所以，微生物固氮是導致干土過程中全氮升高的唯一可能因素。土壤中很多的自生固氮菌屬，如柄桿菌、紅球菌等[16]均可通過自身固氮酶直接把空氣中的氮分子轉化為自身生長發育的營養所需，待其消亡后又以有機態形式補給土壤。吳越等[7]在對福建某林區新鮮土壤的風干過程中也發現7 d后全氮含量比第1天有明顯增大的現象(增幅為20%～30%)，但其只進行2個時段的對比。并且，人為篩選菌種的固氮效率則更為高效，黃慧岳等[17]在湖南分離的某株固氮菌，接種培養第20天土壤全氮含量達到整個培養過程的最大值(為初始含量的4倍)，且之后全氮含量基本穩定。其固氮效率遠大于吳越等[7]和本研究結果，可能與其土壤接種后是恒溫恒濕培養環境有關，且接種前的滅菌處理排除了其他菌種對該菌種后期固氮效果的干擾。

復水過程是密閉厭氣環境，干土過程前期土壤全氮出現明顯增長，表明研究區域土壤固氮菌是以好氣性菌群為主體的。目前已發現的固氮菌也多屬此類，張崇邦等[18]在浙江天臺山發現好氣性固氮菌群無論從種類還是數量均比厭氣菌占優勢。本研究結果表明，15 d以后3個樣地土壤全氮均出現不同程度的遞減現象，與干土過程導致的土壤水分喪失有關。以次生喬林地為例，干土第1天含水率為12.23%，但到第15天時則僅為4.43%。魏萬玲等[19-20]研究證實，土壤微生物活性、豐度與水分含量呈明顯的正相關關系；林江輝等[11]發現，復水培養5 d時土壤中放線菌和真菌數量甚至還大于新鮮土樣。而地域空間緊臨的公園灌林地之所以全氮峰值不明顯，可能與其是城市休憩公園，農業生產(改建以前為農業用地)與園林管理的藥物噴灑抑制了土壤微生物的活性有關；其土壤脲酶活性為3個樣地最低，也說明該樣地微生物活性有限[21-22]。張瑞福等[22-23]研究表明，固氮菌活性因農藥影響而受到不同程度的抑制。

苗圃園地和次生喬林地全氮含量均在25～30 d回落并趨于穩定，表明生物固氮與氮素礦質化的耗損在逐步接近平衡。即水分逐步降低微生物休眠甚至是死亡，導致其活性下降進而致使礦質化作用被抑制，固氮作用、氨化、硝化與反硝化等生化過程均趨于緩慢或停滯狀態。復水過程雖然激活了風干土壤菌群的生物活性[10]，但隨著干土過程的持續推進，新增殖的固氮菌受干旱脅迫又大量消亡，其殘體細胞內物質滲出并迅速被礦質化[7]。沈其榮等[3]通過施加同位素氮肥法對比發現，干土效應導致被分解的有機氮絕大多數來自于施肥而新增的微生物體，且新固定態氮的礦化率是未施肥對照土樣的5倍；GROGAN等[25]也有類似研究結論，因此導致在第30～40天以后全氮含量走勢平穩直至整個風干過程結束，且與新鮮土樣含量基本持平。所以，復水干土后的土壤可以基本表征新鮮土樣的全氮含量。但務必使土壤徹底風干，以保證新固定的氮又隨微生物殘體的氨化或反硝化等過程而損耗。

無機氮含量變化方面，在復水干土過程第1天土壤銨態氮出現峰值后就逐步下降并穩定。這是因為銨態氮源于蛋白酶對有機物的分解，且無論好氣與否均有微生物參與該過程。厭氣復水過程導致了土壤微生物的增殖，其代謝死亡殘體被分解會產生氨。劉亞軍等[26]也發現，土壤水分的增加對銨態氮含量有顯著的提升作用。干土過程第3天3個樣地土壤亞硝態氮已顯著下降，而硝態氮在同一天則有明顯上升態勢(苗圃園地則延續到第5天仍在增長)。這是由于硝化作用的參與者氨氧化菌(AOA和AOB)和亞硝酸氧化菌(NOB)的絕大多數都是好氧菌群，雖然氨氮是其菌群增殖的底物，但厭氣條件下其無法對氨進行硝化，導致干土初始時所有土樣銨態氮含量都非常大。好氣干土過程一旦啟動，氮素的礦質化由氨化與反硝化作用為主體轉變為氨化和硝化作用為主導，亞硝態氮含量迅速下降而硝化產物即硝態氮含量迅速升高。即表現為干土過程結束時(第85天)相對于第1天的硝化率(硝態氮與無機總氮含量之比)的大幅增長，公園灌林地(由7.10%增至14.70%)、苗圃園地(由3.30%增至14.94%)和次生喬林地(13.21%增至39.43%)分別增長1.07倍、3.52倍和1.98倍。增長倍數在苗圃園地為最大，并且其第1天銨態氮含量即高達62.51 mg/kg，明顯大于其余2個樣地。但其有機質含量和脲酶活性反而均低于次生喬林地，具體原因有待于后續研究。

干土過程中后期土壤亞硝態氮與硝態氮出現波動與風干環境密切相關。許多研究表明，微生物對介質酸堿性、含氧量、溫度、水分和光輻射等環境條件敏感。鑒于該研究是在室內非恒溫開放環境實施的，因此最易產生變化的環境因素就是土壤水分和大氣溫度。第40天以后的水分曲線波動很可能與之前的溫度較高(大于15℃)有關。干土中期階段環境條件穩定相關菌群活性也較為平穩，導致無機三氮在此時段總體上較為穩定。但是當環境條件發生明顯改變時，此平衡被打破。在第55天和第85天前后有冷空氣過境，氣溫曲線表現為低-高-低的特點。硝態氮曲線與其完全一致，而亞硝態氮則恰恰相反，呈現出高-低-高的態勢。表明，硝化過程不同階段的微生物對環境條件突變的響應存在著差異。相對于亞硝酸氧化菌，氨氧化菌在應對豐水、氧氣匱乏、低溫等環境脅迫方面有更強的適應性[27]。從土壤含水率看，干土早期呈近線性的下降特點，約7 d后含水率趨穩且呈微幅波動狀態。這是因為在干土早期結束后，原復水過程主要存在于毛管孔隙的吸濕水分也逐步蒸發而消耗，此后土壤吸濕水含量則顯著受大氣濕度變化影響，而大氣濕度又制約于溫度條件。第55天時3個土樣含水率與前后相比均有峰值，這與冷空氣侵襲造成的大氣飽和水汽壓下降，空氣中水汽在土粒表面凝結有關[28]。閆鐘清等[13]原位土壤實驗顯示水分增加可誘發硝酸還原酶活性，而對亞硝酸還原酶則表現為抑制，兩者共同作用的結果是產生亞硝態氮的累積，其他學者也有類似發現[29-30]。但含水率并不是唯一的影響因素，如第85天氣溫維持在4℃左右，此時3個土樣含水率與各自30～40 d(氣溫為12℃)含水率十分接近，但亞硝態氮含量卻顯著高于30～40 d的含量。江秋群等[31]在對同一城區大氣環境中也發現，亞硝態氮沉降通量在冬季為全年最大。這表明環境水分相對穩定條件下，低溫對亞硝酸氧化菌的抑制作用較氨氧化菌明顯，表現為氨氧化菌的生化產物亞硝酸根無法被有效損耗而累積。

雖然本案例得到大氣環境穩定條件下第40天可以作為復水干土替代新鮮土進行無機氮檢測的時間節點。但從數據本身看，即使是M值最小的第40天，干土過程中的土壤銨態氮、亞硝態氮和硝態氮與鮮土相比，都分別有0.682 mg/kg、0.053 mg/kg、和0.670 mg/kg的絕對差值，相對誤差為9.89%～42.30%，最大相對誤差出現在絕對含量最低的亞硝態氮指標上。因此，從嚴謹的治學精神和務實的研究態度來看，土壤氮的測定還是以鮮土為理想用土。

4 結論

由于復水過程激活了土壤固氮菌活性導致干土中期全氮出現顯著峰值，約為復水結束時含量的1.50倍。隨著水分喪失峰值逐步消退并保持到整個干土過程的結束。干土后期與鮮土相比全氮僅有約5%差異，因此徹底風干后的土壤可替代鮮土實施全氮檢測。

厭氣復水致使土壤銨態氮在干土初期達到最大。干土過程導致土壤硝化率明顯提升，這與硝化菌的好氧性質有關。干土早期是復水后土壤氮素平衡的調整期，干土中期無機三氮則穩定少變。干土后期亞硝態氮和硝態氮含量受大氣環境影響顯著，尤以亞硝態氮波動最為劇烈。這是因為同等土壤水分條件下，低溫對亞硝酸氧化菌的抑制作用較氨氧化菌明顯，亞硝酸根無法被損耗而累積。

大氣環境條件穩定情況下復水風干40 d以后可作為替代新鮮土進行無機氮檢測的時間節點。但與鮮土相比會存在一定的誤差。鮮土仍是土壤檢測的理想用土。不同自然環境土壤涉氮微生物種類及固氮效果差異明顯，土壤、大氣等自然環境與土地利用等人文環境也不盡一致，該研究結果的普適性如何，有待于與其他地域作對比和驗證。