下丘腦內側基底部神經元HIF1α 缺失對小鼠體重和糖代謝的影響

艾孜買提·肉孜江 單瑋碧 郭 海 姚巧玲

1.新疆醫科大學基礎醫學院生理學教研室，新疆烏魯木齊 830011；2.新疆醫科大學第一附屬醫院麻醉科，新疆烏魯木齊 830011；3.新疆醫科大學第一附屬醫院皮膚科，新疆烏魯木齊 830011

肥胖癥是指各種疾病引起的能量攝入超過能量消耗導致體重、體脂含量增加的代謝性疾病，會增加多種疾病的患病風險[1-5]。缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）是細胞在缺氧狀態下穩定表達，并參與各種適應性反應的一種核轉錄因子[6-8]，下丘腦弓狀核或促黑素（pro-opiomelanocortin，POMC）神經元中的HIF 可能在高脂飼料喂養下或老年狀態下參與小鼠食欲及體重的平衡調節[9-11]。HIF 對體重調控是否僅在高脂飼料或老年狀態下存在，目前尚不清楚。

因此，本研究擬敲除缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF1α）flox/flox小鼠下丘腦內側基底部（mediobasal hypothalamus，MBH）神經元中的HIF1α，探究MBH 神經元中HIF1α 在小鼠體重和糖代謝中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和整體設計

選用30 只HIF1αflox/flox雄鼠（實驗動物生產許可證號：SYXK（新）2018-0002），周齡6～8 周，體重23 g左右。將體重相近的兩只小鼠隨機分在兩組，兩組小鼠平均體重相差不大于2 g，每組15 只。均在注射后第5 天起每天19:30 稱量體重和進食量。

1.2 病毒注射

實驗組小鼠MBH 注射cre 腺相關病毒AAVhSyn-cre-GFP，選擇性敲除MBH 神經元中的HIF1α；對照組小鼠注射AAV-hSyn-GFP。兩組注射部位均為下丘腦內側基底部神經元[前囟-1.5，中線±0.5（兩側），背腹5.8（顱骨表面）]。注射濃度均為1.45E+13 v.g./mL的病毒0.5 μL（上海吉凱基因，GCPV0181762）。

1.3 制作冰凍切片觀察病毒注射的位置及表達情況

病毒注射28 d 后，每組隨機選取3 只小鼠經心臟灌注4%多聚甲醛5 min 后取腦組織，分別在4%多聚甲醛和20%的蔗糖溶液4℃中放置24 h，用2-Methylbutane速凍（SIGMA-ALDRICH STBH3448）并存于-80℃。用O.C.T.Compound 固定于冰凍切片機（Leica，CM1860）做30 μm 切片并貼片，在熒光顯微鏡（Leica，DMI6000B）下觀察并拍片。

1.4 試劑盒分析

病毒注射28 d 后，選取剩余12 只小鼠，使用葡萄糖比色法測試盒（Elabscience，E-BC-K268）檢測血清中葡萄糖含量；使用Mouse Insulin ELISA Kit（Raybio，ELM-Insulin）檢測血清胰島素含量。

1.5 統計學方法

采用SPSS 26.0 統計學軟件對所得數據進行分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t 檢驗，不同時間點比較采用重復測量方差分析，組間比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MBH 神經元HIF1α 的缺失對小鼠體重和進食量的影響

整體分析小鼠體重發現，組間比較、時間點比較及交互作用差異均有統計學意義（P ＜0.05）；提示病毒注射后隨著時間變化，兩組小鼠體重差異越來越明顯。進一步兩兩比較，組內比較：兩組小鼠第15、25、28 天的體重均高于第5 天，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）；組間比較：實驗組第15、25、28 天的體重高于對照組，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。見表1。

整體分析小鼠進食量發現，組間比較、時間點比較及交互作用差異有統計學意義（P ＜0.05）；提示病毒注射后隨著時間變化，兩組小鼠進食量差異越來越明顯。進一步兩兩比較，組內比較：對照組第15、25、28 天與第5 天進食量比較，差異無統計學意義（P ＞0.05），實驗組第15、25、28 天的進食量均高于第5 天；差異均有統計學意義（均P ＜0.05）；組間比較：實驗組第15、25、28 天的進食量高于對照組，差異均有統計學意義（均P ＜0.05）。見表1。

表1 MBH 神經元HIF1α 的缺失對小鼠體重和進食量的影響（g，±s）

表1 MBH 神經元HIF1α 的缺失對小鼠體重和進食量的影響（g，±s）

注：與本組第5 天比較，*P ＜0.05；與對照組同一時間點比較，△P ＜0.05。MBH：下丘腦內側基底部；HIF1α：缺氧誘導因子1α

2.2 病毒在下丘腦神經元的定位及表達

圖1A 中綠色熒光區域是下丘腦AAV-hSyn-GFP 的表達位置；圖1B 中綠色熒光是下丘腦AAVhSynGFP-cre 的表達位置。

圖1 病毒注射及表達位置

2.3 MBH 注射AAV-hSyn-GFP 和AAV-hSyn-cre-GFP后HIF1αflox/flox 小鼠血糖、胰島素含量變化及相關性分析

兩組小鼠空腹血糖水平比較，差異無統計學意義（P ＞0.05），見圖2A。與對照組比較，實驗組小鼠血清中的胰島素水平升高，達到（62.17±15.37）μIU/mL，是對照組的3.5 倍，差異有統計學意義（P ＜0.05），見圖2B。分析發現，實驗組小鼠血清胰島素水平與體重呈正相關（r=0.660，P ＜0.05），見圖2C。

圖2 MBH 注射AAV-hSyn-GFP 和AAV-hSyn-cre-GFP 后HIF1αflox/flox 小鼠血糖、胰島素含量變化及相關性分析

3 討論

下丘腦是調節能量代謝的基本中樞[12-15]，可以感知生物代謝動態的信號并作出調節[16-18]。在食源性肥胖中，全身的能量穩態遭到破壞[19-21]。敲除小鼠下丘腦POMC 神經元中的HIF 或弓狀核的HIF-1β，正常飲食下未發現小鼠進食量和體重變化，但高脂飲食下兩者明顯增加[8]。本研究條件性敲除MBH 神經元HIF1α，正常飲食下小鼠的體重及進食量顯著增加，提示下丘腦POMC 神經元和弓狀核區域以外的神經元HIF1α可能也參與體重平衡調節。體重增加早于進食量增加發生，提示MBH 神經元HIF1α 不僅影響小鼠食欲，還可能影響小鼠的能量代謝率。

研究發現HIF 誘導可以增強下丘腦葡萄糖感應[22]，抑制下丘腦HIF 會導致葡萄糖耐受不良與血清胰島素水平升高[10,23-25]。本研究中，MBH 神經元HIF1α 的缺失導致小鼠血清中胰島素含量顯著增加，說明小鼠發生了胰島素抵抗——其血糖水平的正常是更多胰島素分泌的結果。相關性分析結果顯示實驗組小鼠胰島素與體重的變化呈正相關，此時出現的胰島素分泌增加可能是小鼠體重增加導致的繼發后果。MBH 神經元HIF1α 的缺失導致下丘腦對葡萄糖敏感性降低可能是小鼠食欲增加的主要原因。后續將進一步研究MBH 神經元HIF1α 缺失對下丘腦葡萄糖感應、胰島素信號通路和血脂調控通路的影響及機制，進一步了解MBH 神經元HIF1α 如何影響食欲和能量代謝水平。