CXC趨化因子受體4及基質細胞衍生因子-1在成釉細胞瘤中的表達及意義

劉佳意，田小川，鐘鳴，2

（1.中國醫科大學口腔醫學院·附屬口腔醫院口腔病理科，遼寧省口腔疾病重點實驗室，沈陽 110002；2.廈門大學附屬翔安醫院口腔科，福建廈門 361102）

成釉細胞瘤（ameloblastoma，AB）是口頜面部常見的牙源性腫瘤，具有侵襲性生長及術后易復發的特點［1］，現階段以切除為主的治療方案會造成頜面部缺損，因此亟待損傷更小的治療手段。

CXC 趨化因子受體4（CXC chemokine receptor 4，CXCR4）為人趨化因子受體之一［2］，由1個胞外N-末端結構域、1個胞內C-末端結構域、7個跨膜螺旋、3個胞外環和3個胞內環構成［3］，有研究［4］證明CXCR4與其配體基質細胞衍生因子-1（stromal cellderived factor-1，SDF-1）相互作用可觸發多種信號通路。早期的研究［5］顯示，CXCR4有助于人免疫缺陷病毒-1（human immunodeficiency virus type-1，HIV-1）進入宿主細胞，進一步研究發現，CXCR4/ SDF-1也同樣可以影響腫瘤。在包括非小細胞肺癌［6］、乳腺癌［7］等多種腫瘤中CXCR4呈高表達，阻斷CXCR4/SDF-1信號傳導可以明顯抑制腫瘤細胞擴散和生長。現階段CXCR4/SDF-1通路及藥理研究主要集中在惡性腫瘤方面，它在AB中的表達及意義尚不清楚，本研究通過檢測兩者mRNA及蛋白表達并結合臨床資料探討其在AB中的表達及意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集：免疫組化所使用樣本來自中國醫科大學附屬口腔醫院2007年至2012年口腔病理科留存的80例AB及10例口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）存檔蠟塊；搜集該院10例經口外門診智齒拔除術帶出的正常黏膜（normal oral mucosa，NOM）作為對照。AB病例按照2017 WHO分類標準進行病理分型，其中，男40例，女40例；年齡18～79歲，平均年齡為49歲；發生于下頜骨65例，上頜骨12例，其他部位3例；原發76例，復發4例；經典型AB 64例，單囊型AB 13例，骨外/外周型AB 3例。實時定量PCR及Western blotting所用組織來自該院病理科2007年至2012年收治的AB患者-81 ℃凍存標本；其中男16例，女14例；年齡16～72歲，平均年齡為44歲；24例發生于下頜骨，3例發生于上頜骨，3例發生于其他部位；原發16例，復發12例，惡變2例；經典型AB 26例，單囊型AB 1例，骨外/外周型AB 3例。本研究經患者知情同意，獲得醫院倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑：兔抗人CXCR4多克隆抗體及SDF-1多克隆抗體均購自英國Abcam公司；DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實時定量PCR：將組織取出后立刻剪碎，并置于TRIzol充分裂解提純RNA，定量后選取純度較高RNA反轉為cDNA，按照試劑說明配制混合液并加樣；整個加樣實驗全程避光，實驗器材及試劑保持冰浴；選取GAPDH作為內參，采取2-ΔΔCt法計算AB與NOM的目的基因相對表達量；PCR引物序列見表1。

表1 相關引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.2 Western blotting：取適量組織剪碎勻漿并加入適量組織裂解液至勻漿完全；4 ℃、12 000g離心1 h，取上清測濃度，加入loading buffer后置于100 ℃水浴5 min，獲取蛋白樣品備用。蛋白上樣量為15 μg，按操作說明電泳，待marker顯示目的蛋白與內參分開時停止電泳并轉膜，轉膜結束后將膜置于封閉液內室溫搖床封閉1 h，封閉結束后分別孵育目的蛋白與內參，4 ℃、16 h。次日經一抗回收，洗膜，孵育二抗及洗膜后發光，通過Image-J軟件分析條帶灰度值。

1.2.3 免疫組化：采用SP三步法。石蠟標本常規4 μm切片，脫蠟，洗片，抗原修復，使用二抗來源動物非免疫血清孵育切片以防止抗體非特異性吸附，一抗孵育，工作濃度1∶100，二抗37 ℃ 30 min，DAB顯色，蘇木素核復染；陰性對照為0.01 mol/L PBS。判讀標準：計數并評分每個視野下的染色強度及陽性瘤細胞百分比。細胞質無著色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別計0、1、2和3分；陽性瘤細胞占比0%、＞0%～25%、＞25%～50%、＞50%分別計0、1、2和3分，兩者乘積為該片得分，0分，陰性（-），1～3分，弱陽性（+），4～6分，中等陽性（++），＞6分，強陽性（+++）。

1.3 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，實時PCR和Western blotting結果采用配對t檢驗，免疫組化結果采用方差分析，計算組內及組間差異，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實時定量PCR

AB中CXCR4mRNA表達水平為NOM的4.82倍，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；AB中SDF-1mRNA表達水平較NOM高4.06倍，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 Western blotting

AB中CXCR4蛋白表達水平顯著高于NOM（P＜0.05），見圖1。CXCR4蛋白在AB及OSCC組織中的表達無統計學差異（P＞ 0.05），見表2；AB中SDF-1蛋白表達水平明顯高于NOM（P＜ 0.05），見圖2，AB中SDF-1表達與OSCC中SDF-1蛋白表達差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見表2。

圖1 CXCR4的Western blotting結果Fig.1 Western blotting results of CXCR4

表2 CXCR4/SDF-1蛋白在不同組織中的表達Tab.2 Expression of CXCR4/SDF-1 protein in different tissues

圖2 SDF-1的Western blotting結果Fig.2 Western blotting results of SDF-1

2.3 免疫組化

CXCR4在NOM中表達呈陰性（圖3A），在OSCC中表達呈陽性（圖3B）；AB中CXCR4表達呈陽性（圖3C），陽性率為87.5%，主要見于細胞質，細胞核及周邊破骨細胞也可見表達；SDF-1在NOM 中表達呈陰性（圖3D），在OSCC中表達呈陽性（圖3E）；在AB中的陽性表達率為85%，主要見于細胞質，也可見于細胞核及破骨細胞（圖3F，表3）。

表3 各分型AB中CXCR4及SDF-1評分情況 ［n （%）］Tab.3 Scores of CXCR4 and SDF-1 in AB of each type ［n （%）］

圖3 CXCR4及SDF-1免疫組化結果Fig.3 Immunohistochemical results of CXCR4 and SDF-1

3 討論

對于大部分惡性腫瘤及有侵襲和復發傾向的良性腫瘤，目前主要傾向于進行手術治療或放化療，以期達到根治目的，雖然療效顯著，但不良反應重，后期可能還面臨植骨等問題。CXCR4/SDF-1作為近些年研究的熱點，其相應的抑制劑無論是單獨用藥還是聯合用藥都顯現出良好的應用前景，因此，深入了解CXCR4/SDF-1致病機理十分關鍵。

CXCR4/SDF-1可直接影響器官和組織的再生，關于肺［8］、心臟［9］、肝臟［10］等的研究均證實了此觀點。由于CXCR4/SDF-1介導的組織再生與增殖相關通路激活聯系緊密，使得腫瘤也可通過改變CXCR4/SDF-1來促進腫瘤細胞增殖。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）對于機體生長極為關鍵，其能夠促進合成代謝并抑制分解代謝，進而調控細胞生長，自噬等關鍵過程［11］，上述功能主要經由mTOR復合物1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）和mTOR復合物2（mammalian target of rapamycin complex 2，mTORC2）經由各自底物傳遞信號實現［12］。研究［13］顯示，阻斷CXCR4/SDF-1可明顯抑制mTOR相關通路并抑制腫瘤生長，針對于AB的研究也得出了相似的結果，LI等［14］發現，相較于正常口腔黏膜組織，AB原發灶及復發灶的mTOR表達明顯升高，本研究結果顯示，AB中CXCR4及其配體表達明顯高于NOM組織，這與上述研究結果趨勢相吻合，提示CXCR4/SDF-1激活可通過改變mTOR通路進而介導AB易復發這一異常生物學行為。

除此之外，本研究發現AB中CXCR4及SDF-1免疫組化檢測均可見破骨細胞陽性表達，提示CXCR4/SDF-1與AB的侵襲存在一定聯系。上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）可以使上皮細胞失去連接及黏附能力并獲得遷移及浸潤游走能力。病理狀態下，腫瘤可通過EMT獲得更強的侵襲能力［15］。這種能力的獲得與腫瘤細胞的某些通路異常改變聯系密切。上皮鈣黏著蛋白（E-cadherin，ECAD）表達降低及波形蛋白（vimentin，VIM）的表達升高是EMT過程中最顯著的表型之一［16］。LIN等［17］研究顯示，CXCR4/SDF-1過表達可激活核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）相關通路從而引起ECAD水平降低及VIM表達增加，另外，CXCR4/SDF-1也可通過激活mTOR相關信號增強腫瘤EMT潛能［18］。本課題組前期研究［19］顯示，相較于NOM組織，AB組織中ECAD表達下降而VIM表達上升，提示AB中EMT明顯激活，結合本研究中CXCR4/SDF-1在AB破骨細胞中表達呈陽性這一結果提示CXCR4/SDF-1在AB侵襲性生長這一異常生物學行為中扮演重要角色，可能通過多種通路激活EMT，從而促進AB侵襲性生長。

綜上所述，AB中CXCR4及其配體表達水平明顯高于NOM，且可見破骨細胞陽性表達，提示其可能通過激活多種通路介導AB發生發展。CXCR4/SDF-1介導AB侵襲及復發的具體機制仍需進一步研究。