酵母雙雜交篩選與星狀病毒衣殼蛋白ORF2互作的宿主蛋白

李香雨，于漫，聶梓陶，陳彥如，王嘉會，韓喜彬，趙微

（錦州醫科大學基礎醫學院實驗動物學教研室，遼寧 錦州 121200）

星狀病毒是引起嬰幼兒及免疫缺陷人群腹瀉的重要病原體，發病率僅次于輪狀病毒，常與其他腸道病毒混合感染，造成患兒嚴重腹瀉甚至死亡［1］。由于星狀病毒屬于食源性和醫院獲得性病原體，常呈現群體爆發感染，嚴重危害公共衛生安全［2-3］。

星狀病毒為星狀病毒科無囊膜、單股、正鏈RNA病毒。人星狀病毒（human astrovirus，HAstV）具有8個傳統的血清型（HAstV 1～8）及3種新的亞型（MLB型、VA型及HMO型）［4］。其中，HAstV-1型在嬰幼兒群體中感染最為普遍［5］。HAstV基因組編碼非結構蛋白nsP1a（編碼3C-like 絲氨酸蛋白酶）、非結構蛋白nsP1b（編碼RNA依賴性的RNA聚合酶RdRp）和結構蛋白ORF2（編碼病毒衣殼蛋白）3種蛋白。ORF2蛋白主要決定了細胞的嗜異性，并能夠刺激宿主細胞產生應答，是參與調控細胞基因的轉錄與表達及參與病毒受體結合的重要成分，在病毒粒子的成熟和包裝中起重要作用［6-8］，因此，以ORF2為靶基因篩選與之互作的蛋白具有重要意義。

酵母雙雜交系統是基于轉錄因子對細胞內蛋白質相互作用進行篩選與鑒定的系統，已被廣泛應用于病毒與宿主的互作研究［9-10］。本研究利用實驗室分離到的HAstV-1型1d亞株作為模板，將病毒衣殼蛋白ORF2基因成功克隆到酵母雙雜交表達載體pGBKT7中，并以ORF2作為誘餌蛋白，從人結腸癌細胞Caco-2 cDNA文庫中初步鑒定與ORF2存在相互作用的宿主蛋白，為進一步研究ORF2的生物學功能及參與病毒致病性等方面奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

HAstV-1d病毒株、人Caco-2 cDNA 文庫、Caco-2細胞、pMD-18T-ORF2質粒為本實驗室保存。Y2H 酵母感受態細胞、膠回收試劑盒、Prime STAR HS DNA聚合酶、dNTP、限制性內切酶NdeⅠ、SalⅠ、T4DNA連接酶、DNA Marker、2×蛋白上樣緩沖液，均購自大連TaKaRa公司；質粒pGBKT7、pGBKT7-53、pGADT7、pGADT7-T、酵母質粒小提試劑盒和酵母雙雜交試劑盒及各種營養缺陷型培養基均購自美國Clontech公司；Lipofectamine3000轉染試劑、ECL發光試劑盒購自美國Thermo 公司；胎牛血清、DMEM培養基、胰蛋白酶購自美國GIBCO 公司。

1.2 方法

1.2.1 構建pGBKT7-ORF2誘餌表達載體：以HAstV-1d病毒株衣殼蛋白pMD-18T-ORF2質粒作為模板，設計針對ORF2的PCR引物，ORF-F引物序列為5’-CA TATGATGGCTAGCAAGTCCAATAAGCAGGTAA CT-3’；ORF-R引物序列為5’-GTCGACCTCGGCGTG GCCGCGGCTTCCAGAAGT-3’。分別用Prime STAR HS DNA聚合酶進行PCR擴增，經1%瓊脂糖凝膠檢測、回收，用 NdeⅠ和SalⅠ對PCR產物和pGBKT7質粒分別進行雙酶切、鑒定、回收。再經T4 連接酶連接并轉化DH5α感受態細胞。用檢測引物ORF-F和ORF-R對得到的轉化子進行菌落PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠檢測，并將陽性轉化子送上海杰李公司進行測序。

1.2.2 誘餌蛋白自激活性鑒定：將pGBKT7-ORF2和pGADT7共轉化至Y2H Gold中，以pGADT7-T和pGADT7-53作為陽性對照、pGBKT7-Lam 和pGADT7-T作為陰性對照。轉化菌液于SD/-Leu/-Trp和SD/-Leu/-Trp/-His固體培養基上劃線，30 ℃培養3～5 d。觀察是否有藍色克隆菌生長，判斷是否有自激活及毒性作用。

1.2.3 酵母雙雜交篩選與鑒定：酵母雙雜交篩選按照說明書進行。將誘餌質粒pGBKT7-ORF2轉化至Y2H酵母感受態細胞，并接種到全培養基中，30 ℃培養24 h，OD600值達到1時收集細胞。用5 mL SD/-Trp液體培養基進行重懸，加入 1 mL Caco-2 cDNA 文庫（克隆數＞2×107）。培養 24 h 后，取少許菌液在顯微鏡下觀察菌體形態，判斷是否融合。將融合的菌液涂布于SD/-Trp/-Leu/-His培養基進行初步篩選，獲得的陽性菌落涂布于 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 固體培養基上，30 ℃培養3～5 d，進行第二次篩選。挑選二次篩選到的陽性菌落接種到 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/AbA/X-α-gal培養基，30 ℃培養 3～5 d，進一步篩選。陽性菌落，經菌液 PCR 擴增ORF2基因，回收后送上海杰李公司進行序列測定。獲得的序列信息在NCBI數據庫中進行檢索與對比，確定互作蛋白的基因序列信息。

2 結果

2.1 酵母誘餌質粒pGBKT7-ORF2的鑒定

用ORF-R與ORF-F引物對已構建好的重組質粒pGBKT7-ORF2進行菌落PCR檢測，可擴增出2 364 bp的片段（圖1A），測序結果與HAstV-1d上傳 GenBank的ORF2基因片段（GenBank：KF211475.1）序列一致，說明pGBKT7-ORF2誘餌質粒構建成功。重組質粒經雙酶切鑒定、瓊脂糖凝膠電泳檢測，出現大小為2 364 bp目的條帶（圖1B），與預期相符。

圖1 誘餌載體pGBKT7-ORF2的鑒定Fig.1 Detection of bait plasmid pGBKT7-ORF2 by PCR

2.2 誘餌質粒自激活和毒性檢測

pGBKT7-ORF2和pGADT7、pGADT7-T和pGADT7-53（陽性對照）、pGBKT7-Lam 和pGADT7-T（陰性對照）菌落均能在SD/-Leu/-Trp固體培養基上生長，而僅有pGADT7-T和pGADT7-53在SD/-Leu/-Trp/-His固體培養基上生長，其余均無菌落生長（圖2）。說明ORF2蛋白不能激活酵母菌下游基因，不具有自激活性。

將含pGBKT7-ORF2和pGBKT7質粒的Y2H酵母菌涂布于SD/-Leu/-Trp 培養基培養3 d，結果顯示，pGBKT7-ORF2重組菌與空載體pGBKT7的菌落大小和數量基本一致（圖2B、2C），表明ORF2蛋白對菌體明顯無毒性。

圖2 誘餌質粒自激活和毒性檢測Fig.2 Toxicity and the activation test of pGBKT7-ORF2

2.3 篩選與ORF2 蛋白互作的宿主蛋白

將pGBKT7-ORF2轉化的Y2H酵母菌和Caco-2 cDNA文庫融合得到的菌液涂布于不同報告基因缺失的固體平板進行表型鑒定（圖3A）。經過4輪缺失培養基篩選獲得克隆，將Caco-2細胞cDNA文庫轉化產物104倍稀釋后，在SD/-Trp/-Leu培養基平板進行培養，得到了14個陽性克隆菌（圖3B），總篩選克隆數為1.4×105。

圖3 以pGBKT7-ORF2為誘餌篩選Caco2細胞cDNA文庫Fig.3 Screening of Caco2 cell cDNA library

2.4 陽性克隆菌的回轉驗證及測序分析

對獲得的陽性克隆菌行2次回轉驗證，結果顯示，轉化的菌株能夠在 SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上生長，且在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/Aba平板上菌落呈藍色，與陽性對照結果一致（圖4）。經測序鑒定得到陽性菌的基因序列，與NCBI數據庫中數據進行比對分析，獲得15種蛋白，見表1。

表1 酵母雙雜交系統篩選與ORF2互作的蛋白質Tab.1 Screening of proteins interacting with ORF2 by yeast two-hybrid system

圖4 陽性克隆回轉驗證Fig.4 Return test of pGBKT7-ORF2 proreins

3 討論

星狀病毒ORF2蛋白主要決定了細胞的嗜異性，并能夠刺激宿主細胞產生應答，參與病毒粒子的裝配、核酸的包裝、病毒粒子的成熟［11-12］。目前關于星狀病毒衣殼蛋白與宿主相互作用的報道較少，通過對其結構基因的預測表明，ORF2蛋白的C端與某些病毒相關蛋白和受體具有結構上的相似性［13］，可能參與病毒與受體的結合。

星狀病毒的宿主細胞為Caco-2，該細胞體外培養條件下可自發上皮樣分化，形成與小腸上皮細胞相同的微絨毛結構和緊密連接，與小腸柱狀上皮細胞很相似。因此，本研究選擇Caco-2細胞構建cDNA文庫，進行宿主蛋白篩選［14］。以星狀病毒的ORF2蛋白作為誘餌蛋白，通過酵母雙雜交系統在Caco-2細胞的cDNA文庫中篩選出與ORF2蛋白互作的15種蛋白。對15種蛋白進行了初步功能分析和文獻檢索，其中，纖維連接蛋白1（fibronectin 1，FN）與病毒感染具有相關性［15］。FN1的細胞型是細胞外基質的重要組成部分，在細胞形態形成、遷移、炎癥和表面受體內化等方面發揮作用［16-18］。文獻［19］報道，FN與EV71 病毒顆粒有直接的相互作用，通過促進EV71的入侵促進EV71的感染。而流感病毒H1N1入侵宿主時需要FN的參與［20］。FN能與乙型肝炎病毒（hepatitis B，HBV）的S抗原相互作用，促進其與細胞表面結合［21-22］，并且還可能參與HBV的入侵［23］。而FN1與星狀病毒互作后對病毒感染有何影響目前尚無報道，有待進一步深入研究。

本研究利用酵母雙雜交系統篩選并鑒定出與HAstV-1 ORF2蛋白互作蛋白。后續將進一步對其中感興趣的蛋白，尤其是FN1與ORF2的互作進行免疫共沉淀檢測，并進行基因功能分析，為研究星狀病毒與宿主相互作用、ORF2蛋白功能及病毒的致病機制奠定基礎。