磨損顆粒刺激下小鼠骨髓來源巨噬細胞調控白細胞介素-34表達的實驗研究

劉子歌，今出真司，張晨，宋國瑞，陳德勝

（1.寧夏醫科大學總醫院骨科，銀川 750004；2.日本島根大學附屬醫院矯形外科，日本島根出云 693-8501）

磨損顆粒引起的骨溶解是髖關節或膝關節置換術后假體無菌性松動、假體失效和關節翻修手術的主要原因，嚴重影響關節功能恢復［1］。假體周圍產生的磨損顆粒可引起炎癥反應，主要由促炎巨噬細胞表型主導，提示巨噬細胞極化產生的破骨細胞在磨損顆粒引起的骨溶解中起關鍵作用。核因子κ B受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κ B ligand，RANKL）是破骨細胞分化的關鍵調節劑，由骨髓基質細胞、成骨細胞和活化的T細胞產生的巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）和RANKL是破骨細胞形成所需的細胞因子［2-3］。研究［4］證實，體外培養的RANKL、RANK或TRAF6基因缺陷小鼠的造血干細胞在腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的干預下，也可以分化為破骨細胞，提示破骨細胞分化可能存在其他途徑。M-CSF是造血干細胞分化為巨噬細胞系的關鍵細胞因子，也是小膠質細胞發育必需的。然而，有研究［5］發現，成年M-CSF缺陷小鼠大腦中的小膠質細胞發育正常，表明存在另一種可以替代M-CSF影響該細胞類型的因子。

LIN等［6］發現了一種新的細胞因子白細胞介素（interleukin，IL）-34，它能刺激骨髓細胞的單核細胞活性和巨噬細胞集落形成。因此，本研究假設IL-34作為M-CSF的替代因子，也具有在體外聯合RANKL誘導成熟破骨細胞的作用，并可能在磨粒誘導的破骨細胞形成中起關鍵作用，參與磨損顆粒誘導的假體周圍骨溶解，同時，擬探討IL-34支持破骨細胞生成的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

α-MEM、DMEM培養基、胎牛血清（美國Gibco公司）；鱟內毒素檢測試劑盒（廈門市鱟試劑實驗廠有限公司）；IL-34 ELISA試劑盒（英國Abcam公司）；TRAP染色試劑盒（美國Sigma-Aldrich公司）；M-CSF、RANKL、IL-34（美國R&D公司）；Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反轉錄試劑盒、Ultra SYBR One Step RNA PCR Kit熒光定量PCR試劑盒（日本TaKaRa生物公司）；p38特異性抑制劑SB 202190、細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）特異性抑制劑PD 98059、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）特異性抑制劑SP 600125（美國MCE公司）；p38、p-p38、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、β-actin抗體（美國Cell Signalling公司）。

1.2 原代細胞獲取及TRAP染色

按照HU等［7］的方法，從6周齡C57小鼠的后肢股骨骨髓中分離骨髓巨噬細胞。脫頸處死小鼠，并將其在75%乙醇中浸泡15 min。超凈臺中剝離兩側股骨，剪斷兩端并用DMEM培養基沖洗，直至骨髓發白。DMEM培養基漂洗并離心后，收集細胞，然后在含有10%FBS與50 ng/mL M-CSF的α-MEM培養基中孵育12 h。收集未貼壁的細胞，在37 ℃、5%CO2培養箱中培養過夜后，將貼壁細胞視為小鼠骨髓來源巨噬細胞（bone marrow-derived macrophages，BMMs）。將細胞分為3組：（1）Control組，用含10% 胎牛血清的α-MEM培養基培養；（2）M-CSF組，用含10% 胎牛血清的α-MEM培養基+30 ng/mL M-CSF+100 ng/mL RANKL培養；（3）IL-34組，用含10%胎牛血清的α-MEM培養基+30 ng/mL IL-34+100 ng/mL RANKL培養。每2 d更換1次培養液，直至形成成熟的破骨細胞。用TRAP染色試劑盒對細胞進行分析。TRAP陽性細胞超過3個核認定為破骨細胞，在顯微鏡下計數。

1.3 鈷鉻鉬合金（cobalt-chromium-molybdenum alloy，CoCrMo）顆粒的準備

CoCrMo顆粒由日本島根大學附屬醫院矯形外科今出真司博士提供，平均粒徑為23.72 nm。將顆粒在121 ℃下高壓滅菌15 min。在75%乙醇中重懸鈦顆粒，水平搖床晃動48 h后，置于超凈工作臺中紫外線照射晾干。在后續實驗中，將CoCrMo顆粒在細胞培養液中進一步稀釋其濃度至10～500 μg/mL不等，并在將其暴露于細胞之前在超聲震蕩儀中震蕩混勻作用5 min。所有顆粒均經過商用鱟內毒素檢測試劑盒檢測，確保內毒素含量＜0.1 EU/mL。

1.4 RT-PCR法檢測IL-34 mRNA的相對表達量

將上述提取到的BMMs在37℃、5%CO2的細胞培養箱中用含有10%胎牛血清、青霉素（100 IU/mL）和鏈霉素（100 μg/mL）的α-MEM培養基培養。當細胞融合至70%時，加入含0、1、10、100 μg/mL CoCrMo顆粒的培養基培養24 h，或加入100 μg/mL的CoCrMo顆粒分別培養1、6、12、24 h。分別使用特異性信號通路抑制劑［p38特異性抑制劑SB 202190（120 nmol/L），ERK特異性抑制劑PD 98059（120 nmol/L），JNK特異性抑制劑SP 600125（120 nmol/L）］預處理BMMs 1 h后，更換含100 μg/mL CoCrMo顆粒的培養基培養24 h。造模完畢后，使用TRIzol提取總RNA，并使用Prime Script RT Master Mix Kit將1 μg總RNA用于cDNA合成。用Light Cycler FastStart DNA Master SYBR Green I行RT-PCR反應。以β-actin作為內參照。小鼠IL-34引物正向序列為5’-GGACACACTTCTGGGGACA-3’，反向序列為5’-CCAAAGCCACGTCAAGTAGG-3’。以2-ΔΔCt表示細胞中目的mRNA的相對表達量。

1.5 ELISA法檢測細胞培養上清IL-34含量

分別收集各組的細胞培養上清液，離心去除懸浮的CoCrMo顆粒。按照商用小鼠IL-34 ELISA試劑盒說明書的步驟，對各組細胞培養上清液中IL-34的分泌量進行檢測。

1.6 Western blotting檢測絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路中轉導蛋白的表達量

用特異性信號通路抑制劑（120 nmol/L SB 202190、PD 98059、SP 600125）預處理BMMs 1 h，更換含100 μg/mL CoCrMo顆粒的培養基培養24 h后，RIPA裂解細胞，離心，收集上清液。BCA法測定樣品蛋白濃度。蛋白（每組30 μg）上樣，行10% SDS PAGE，轉至PVDF膜，分別加入p38（1∶1 000）、p-p38（1∶1 000）、ERK（1∶1 500）、p-ERK（1∶1 500）、JNK（1∶1 000）、p-ERK（1∶1 000）和β-actin（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育封閉過夜，二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h，顯色，曝光。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 IL-34可促進RANKL誘導的破骨細胞生成

TRAP染色是鑒定破骨細胞分化成熟的金標準，如觀察到細胞核≥3個且同時呈TRAP陽性染色（酒紅色），即可認定為破骨細胞。M-CSF+RANKL是標準的體外誘導BMMs形成破骨細胞的方法［8］。TRAP染色結果顯示，與 Control組比較，IL-34組破骨細胞數明顯增多，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與M-CSF組比較，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。提示IL-34在體外同樣具有促進破骨細胞形成的作用。見圖1。

圖1 IL-34促進RANKL誘導的破骨細胞生成 TRAP染色×40Fig.1 IL-34 promotes RANKL-induced osteoclastogenesis TRAP staining ×40

2.2 CoCrMo顆粒可上調BMMs中IL-34的表達

RT-PCR結果顯示，CoCrMo顆粒以時間和劑量依賴的方式促進BMMs中IL-34mRNA的表達（圖2 A、2B）。ELISA結果顯示，與RT-PCR一致，CoCrMo顆粒誘導的IL-34表達量呈時間和劑量依賴性（圖2 C、2D）。

圖2 CoCrMo磨損顆粒上調BMMs中IL-34的表達Fig.2 CoCrMo wear particles up-regulated the expression of IL-34 in BMMs

2.3 CoCrMo顆粒通過ERK和JNK信號通路調節BMMs中IL-34的表達

MAPK信號轉導通路在破骨細胞調控及人工關節磨損顆粒誘導骨溶解中起重要作用［9-10］。RTPCR結果顯示，ERK特異性抑制劑（PD 98059）和JNK特異性抑制劑（SP 600125）可降低CoCrMo顆粒刺激 下BMMs中IL-34的表達（P＜ 0.05）。Western blotting結果顯示，CoCrMo顆粒雖然上調了IL-34的表達（P＜ 0.05），但也誘導了JNK和ERK的磷酸化；磷酸化的p38蛋白未見明顯變化；ERK特異性抑制劑（PD 98059）和JNK特異性抑制劑（SP 600125）能顯著降低其磷酸化蛋白的表達（P＜ 0.05）。說明CoCrMo顆粒可能通過ERK、JNK信號通路調控BMMs中IL-34的表達。見圖3。

圖3 CoCrMo顆粒通過ERK和JNK信號通路調節BMMs中IL-34的表達Fig.3 CoCrMo particles regulate the expression of IL-34 in BMMs through the ERK and JNK signaling pathways

3 討論

全關節置換術人工關節假體產生的磨損顆粒可刺激宿主的免疫細胞產生強烈的炎癥反應，進而誘導骨溶解。磨損顆粒主要被巨噬細胞吞噬，產生各種炎性趨化因子和細胞因子［11］。假體周圍骨溶解的病理生理機制尚未完全闡明，但越來越多的證據表明，鈦（titanium，Ti）、聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）、超高分子量聚乙烯（ultra-high molecular weight polyethylene，UHMWPE）和鈷鉻等材料的磨屑導致了破骨細胞被過度激活［12-13］。而破骨細胞是體內唯一的骨吸收細胞。所以抑制破骨細胞的形成被認為是治療無菌性松動的一個潛在新方向。體內破骨細胞受多種細胞因子的調節，RANKL和M-CSF被認為是協調破骨細胞分化和存活的2個關鍵因子［14］。M-CSF主要調節細胞黏附、分化、融合和吸收活性［15］；RANKL則致力于破骨細胞的融合、激活和存活［16］。RANKL和M-CSF代表著破骨細胞形成的典型途徑。

有研究［17］報道了存在可以替代RANKL在體外促進破骨細胞生成的細胞因子，如TNF-α、IL-11和IL-8。然而，PARK等［18］發現RANKL基因敲除小鼠未能檢測到TRAP陽性的未成熟或成熟的多核破骨細胞，故認為體內破骨細胞分化對RANKL的表達存在絕對依賴性。而M-CSF在體外和體內均可被血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）或肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）配體替代。ADAMOPOULOS等［19］還發現HGF可以替代M-CSF在體外刺激人破骨細胞的形成。IL-34是最近發現的一種細胞因子，它通過集落刺激因子-1受體作為髓系分化、增殖和存活的調節因子發揮作用。研究［3，20］表明，IL-34不僅在調節破骨細胞生成中起重要作用，在體外和體內均能促進破骨細胞的骨吸收活性。本研究結果顯示，IL-34在RANKL誘導的破骨細胞生成中起重要作用，可以替代M-CSF，支持破骨細胞分化，與M-CSF具有相同的作用。IL-34和RANKL的聯合作用能夠在體外誘導出多核破骨細胞。RT-PCR和ELISA結果顯示，CoCrMo磨損顆粒呈時間和濃度梯度上調BMMs中IL-34的表達。因此，IL-34可能在磨損顆粒誘導的破骨細胞形成中起主導作用。EDA等［21］的研究結果證實，炎性細胞因子TNF-α和IL-1β能夠通過ERK/JNK信號通路刺激破骨細胞前體細胞中IL-34的分泌。CoCrMo磨損顆粒已被證明可以激活MAPK信號通路。因此，本研究中利用Western blotting和RT-PCR進一步檢測了CoCrMo刺激下BMMs中磷酸化p38、JNK、ERK和IL-34的表達水平。結果顯示，CoCrMo磨損顆粒通過激活ERK/JNK信號通路上調了IL-34的表達，且 ERK和JNK特異性信號通路抑制劑（PD 98059、SP 600125）能夠相應地降低由磨損顆粒刺激下誘導的IL-34的表達水平。

研究證實，各種磨損顆粒是導致人工關節假體周圍骨質溶解和繼發性無菌性松動的主要原因，目前研究的磨損顆粒主要包括Ti、CoCrMo、UHMWPE、PMMA和骨水泥磨損顆粒。隨著超高交聯聚乙烯與陶瓷襯墊和生物固定概念的逐漸興起，由 PMMA和UHMWPE磨損顆粒引起的假體周圍骨溶解有望在材料層面被解決［22］。然而，金屬材質的磨損顆粒仍然是一個有待解決的問題。某些臨床研究［23-25］證實了Ti和CoCrMo制成的金屬對金屬界面的人工關節假體較其他材料假體松動率和翻修率更高。LI等［26］研究證實，CoCrMo和Ti顆粒均可誘導體內的骨溶解，且CoCrMo顆粒可產生更強烈的炎性骨溶解反應。這也是本研究選用CoCrMo顆粒作為研究材料的原因之一。

綜上所述，本研究證明了IL-34與M-CSF同樣可以在體外誘導與RANKL共培養的破骨細胞的生成。此外，CoCrMo能通過ERK/JNK信號轉導通路增強BMMs中IL-34的表達。提示IL-34在磨損顆粒誘導的假體周圍骨溶解中起重要作用，可能是未來治療無菌性松動的一個潛在的新靶點。