5-羥色胺在小鼠慢性背根神經節壓迫模型中的作用機制

王濤，陶金，方燁紅，崔歡，馬超

（中國醫學科學院基礎醫學研究所，北京協和醫學院基礎學院人體解剖與組織胚胎學系，北京 100005）

慢性背根神經節壓迫（chronic compression of dorsal root ganglion，CCD）模型能夠最大程度模擬臨床腰椎間盤突出患者的癥狀［1］，是研究慢性神經病理性疼痛的動物模型。背根神經節（dorsal root ganglion，DRG）初級感覺神經元可以將皮膚感受致癢與致痛刺激通過外周軸突、中樞軸突傳遞給脊髓［2］。CCD可以增加感覺神經元自發放電活動，提高神經元胞體的興奮性，增強對溫度感受器和化學感受器刺激的反應［3］。5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）是抑制性神經遞質，廣泛存在于哺乳動物組織中，尤其在大腦皮質及神經突觸內含量很高。5-HT受體分型比較復雜，已發現7種5-HT受體亞型［4］。5-HT在小鼠CCD模型中引起痛覺與癢覺敏化的作用機制仍不清楚，本研究探討CCD模型小鼠感受野注射5-HT產生痛覺敏化和癢覺敏化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6雄性小鼠24只，體質量25～30 g，分別用于行為學實驗（低劑量組6只，高劑量組6只）、免疫熒光實驗（左側為對照側，右側為CCD手術側，n=6）、實時PCR實驗（左側為對照側，右側為CCD手術側，n=6）。小鼠飼養和實驗程序嚴格按照北京協和醫學院基礎醫學研究所的《實驗動物護理和使用指南》與相關的道德規范執行，自由飲用清潔食物和水，維持12 h的晝夜循環。

1.2 小鼠CCD模型建立

3%異氟醚麻醉小鼠，沿背部中線切口，將腰椎旁的肌肉與乳頭突、橫突分離后暴露右側腰椎L3、L4椎間孔。將L形的不銹鋼棒（直徑=0.3 mm，長度=2 mm）插入每個孔中壓迫DRG［7］，誘導CCD。然后將切口分層縫合，局部涂抹含有抗生素（TriTop）軟膏。小鼠完成行為測試后氣體麻醉處死，移除神經外膜并用生理鹽水沖洗后對接受CCD手術的DRG進行顯微鏡檢查以確認不銹鋼棒位置。

1.3 小鼠行為學分析

在一個圓柱形玻璃容器（直徑20 cm）底部放置泡沫，泡沫上面以直角放置2個小鏡子，以便能夠清楚看到小鼠的行為。實驗人員使用高清晰攝像機，分別在CCD前1 d和CCD后1、3、5、7 d記錄小鼠注射5-HT后的行為。每次實驗前將小鼠放在容器中適應環境10 min，然后在小鼠右足皮內注射10 μL 5-HT［8］（低劑量組：0.003 μg/10 μL，n=6；高劑量組：0.3 μg/10 μL），注射后立即開始記錄，持續記錄30 min。小鼠注射藥物產生傷害性（疼痛）感覺，會舔向注射部位，而瘙癢刺激能引起咬的行為。因此，通過錄像視頻計算舔和咬注射部位的累積持續時間來評估小鼠疼痛和癢的行為。

1.4 免疫熒光實驗

小鼠CCD術后5 d，用PBS和4%多聚甲醛經心臟灌注后快速取出L3、L4的DRG，用4%多聚甲醛4℃固定4 h，然后放入30%蔗糖4 ℃過夜。OCT冷凍組織后切片（厚度12 μm）。冰凍切片37 ℃干燥1 h后室溫下4%多聚甲醛固定10 min。然后室溫下將載玻片在封閉溶液PBS（10%正常馬血清、0.2%Triton X-100）中封閉1 h，然后加入一抗兔抗小鼠HRH4（GTX78053，1∶400，美國GeneTex公司）4 ℃孵育過夜。第2天取出后PBS洗3次，每次5 min。然后室溫下加入二抗抗兔（A11011，Alexa 568共軛，美國Thermo Fisher公司）孵育1 h，隨后PBS清洗3次，使用含有DAPI封片劑封片（美國VECTASHIELD公司），使用Olympus顯微鏡拍攝圖像。

1.5 實時PCR檢測

按照試劑盒說明書，使用TRIzol試劑提取總RNA。以1 μg總RNA為原料，用Prime ScriptTMRT試劑盒和gDNA Eraser合成cDNA。使用SYBR1預混料Ex-TaqTMⅡ（TliRNaseH Plus）在25 μL反應體積內擴增出感興趣基因和GAPDH。實時PCR條件為94 ℃ 30 s，40個周期，95 ℃ 5 s，55 ℃30 s，72 ℃ 60 s。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 5-HT對CCD小鼠痛行為的影響

結果顯示，與小鼠CCD手術前1 d比較，低劑量組小鼠CCD術后1、3 d痛行為增加（P＜ 0.05）；高劑量組小鼠CCD術后1 d痛行為增加（P＜ 0.05）。與低劑量組同時間比較，高劑量組痛行為明顯增加（均P＜ 0.05）。見表2。

表2 不同劑量5-HT對CCD小鼠痛行為的影響（s）Tab.2 Effects of different 5-HT doses on pain responsive behavior in CCD mice（s）

2.2 5-HT對CCD小鼠癢行為的影響

結果顯示，與小鼠CCD手術前1 d比較，低劑量組小鼠CCD術后3 d癢行為增加顯著（P＜ 0.05）；而高劑量組小鼠CCD術后未見癢行為增加（P＞0.05）。與低劑量組同時間點比較，高劑量組小鼠癢行為明顯增加（均P＜ 0.05）。見表3。

表3 不同劑量5-HT對CCD小鼠癢行為的影響（s）Tab.3 Effects of different 5-HT doses on itching behavior in CCD mice（s）

2.3 CCD小鼠DRG中H4的表達

免疫熒光實驗結果顯示，對側正常DRG的628個神經元中，H4陽性表達的神經元145個（23.08%）；手術側DRG的685個神經元中，H4陽性表達的神經元241個（35.18%），兩者差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 小鼠L3和L4 DRG中H4陽性表達結果 ×200Fig.1 H4 protein expression in L3 and L4 DRG neurons in mice detected by immunofluorescence ×200

2.4 CCD小鼠DRG中5-HTr1a和5-HTr2a mRNA的表達

結果顯示，對照組中5-HTr1amRNA、5-HTr2amRNA分別為20.20±2.18和13.01±1.25，CCD組DRG中5-HTr1a、5-HTr2amRNA分別為15.13±0.16和10.74±1.12，2組比較差異均有統計學意義（均P＜ 0.01）。

3 討論

5-HT可以通過2種方式引起瘙癢，一種是直接激活C類傷害性感受器，另一種是通過刺激皮膚的肥大細胞釋放組胺來引起瘙癢。本課題組前期研究［5］發現，小鼠CCD模型中受壓迫DRG神經元TRPV1表達上調，引起感受野對辣椒素誘發痛敏化。

CCD可以使小鼠受到正常感受力刺激后增加小鼠后足痛覺過敏的發生率［3，6］。大鼠在腰椎DRG發生CCD后或存在局部炎癥時出現機械行為超敏反應［7］。DRG的自發活動研究［9］證實受壓迫DRG中感覺神經元細胞體高度興奮，提高了對電、熱和化學傷害性刺激的反應。研究［10］顯示，大鼠頸背部中線區域的瘙癢信號主要通過C3DRG傳入脊髓，5-HT受體發揮重要作用。另外，5-HT作為血管活性物質參與偏頭痛的發生，以神經遞質的方式參與偏頭痛的痛覺調節［4］。有研究［11］表明大鼠外周感覺神經元表達的5-HTr2a參與炎癥痛的形成。本研究結果顯示，與低劑量組比較，高劑量組小鼠CCD術后注射5-HT，痛、癢行為均明顯增強（P＜ 0.05），小鼠DRG中5-HTr1a和5-HTr2a表達明顯上調，與癢相關的組胺受體H4表達也明顯上調（均P＜ 0.05），表明5-HT參與了DRG神經元壓迫后痛與癢覺敏化過程，抑制5-HT的產生有可能緩解CCD所引起的痛與癢覺的敏化過程。本研究為臨床治療慢性瘙癢與疼痛提供了一個可能的治療方案和潛在靶點。

綜上所述，CCD可引起小鼠痛覺與癢覺過敏，可能是由于受壓迫DRG神經元H4、5-HTr1a和5-HTr2a表達上調，引起了感受野對5-HT誘發痛與癢的敏化所致。本研究存在的不足之處：給藥方式是皮下注射5-HT，通過刺激外周神經末梢而不是直接作用DRG神經元胞體，不能代表DRG神經元對5-HT刺激的即刻反應情況。今后需對DRG中5-HT產生反應的單個神經元進行單細胞測序，進一步探討其分子機制。