白細胞介素-9及其受體在非小細胞肺癌組織中的表達及臨床意義

高媛，周妍，周新佳，鄭銳

（中國醫科大學附屬盛京醫院 1.呼吸與重癥監護內科；2.耳鼻咽喉科，沈陽 110004）

肺癌是全世界最主要的癌癥死亡原因之一［1］。肺癌根據組織學分為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細胞肺癌，肺癌患者中NSCLC約占85%［2］。研究［3］發現，有2/3的NSCLC患者在診斷時已處于Ⅲ/Ⅳ期，并且超過50%的患者在診斷時已經出現轉移，轉移性晚期NSCLC患者5年生存率低于5%，提高晚期NSCLC患者的生存率需要更多新的治療策略［4］。免疫微環境在控制肺癌發生、發展和轉移中起著至關重要的作用［5］。近年來白細胞介素-9（interleukin-9，IL-9）在腫瘤免疫中的作用得到了越來越多的關注。研究［6］發現在肺癌惡性胸腔積液中輔助性T細胞9（helper T cell 9，Th9）及其分泌的細胞因子IL-9可促進肺癌細胞增殖及遷移，同時促進肺癌細胞與胸膜間皮細胞間黏附，進而促進肺癌惡性胸腔積液進展［6］。但是也有研究［7］發現在不同的腫瘤微環境中IL-9及Th9細胞具有復雜的抗腫瘤及促腫瘤的雙重作用。在黑色素瘤中Th9及IL-9促進CD8+T細胞介導的細胞毒性，進而發揮抗腫瘤作用［8］。IL-9通過刺激抗腫瘤M1巨噬細胞抑制黑素瘤的肺轉移［9］。

目前，癌癥中IL-9促腫瘤和抗腫瘤的作用仍然存在爭議。對于IL-9、白細胞介素-9受體（interleukin-9 receptor，IL-9R）表達與NSCLC的臨床及病理特征關系的研究鮮有報道。本研究探討NSCLC組織中IL-9、IL-9R表達水平及其與臨床病理特征之間的關系，旨在為NSCLC免疫治療提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 材料

收集110例2017年1月至2018年12月中國醫科大學附屬盛京醫院胸外科手術切除并經過病理確診的NSCLC的癌組織及其癌旁正常肺組織（距腫瘤邊緣5 cm以上）石蠟包埋標本。收集其中19例新鮮NSCLC癌組織及其周圍正常肺組織，新鮮組織在液氮中保存。110例患者中男80例，女30例；平均年齡（58.9±7.9）歲，其中年齡＜50歲28例，≥50歲82例；病理分級（分化程度）中高分化80例，低分化30例；腫瘤直徑＜3 cm 42例，腫瘤直徑≥3 cm 68例；明確淋巴結轉移（N1、N2和N3）54例，無淋巴結轉移（N0）56例。根據TNM分期［10］分為：Ⅰ期36例，Ⅱ期28例，Ⅲ 期44例，Ⅳ 期2例。

1.2 免疫組織化學染色及結果判讀

石蠟切片進行脫蠟，抗原修復；3%H2O2室溫孵育15 min，洗片，5%BSA50 μL滴入進行封閉。在室溫下孵育10 min；滴加IL-9（ab 203386；1∶200；英國Abcam公司）、IL-9R一抗（ab 233757；1∶200；英國Abcam公司）4 ℃孵育過夜。然后加入二抗室溫60 min靜置，PBS洗片3次；DAB顯色5 min，蘇木精復染，脫水、透明、封片觀察。

染色結果由2位病理科醫生綜合判定。隨機觀察10個視野（×200），計數視野內細胞總數及染色陽性細胞數，染色陽性細胞百分比評分：0分，著色細胞≤5%（陰性）；1分，著色細胞＞5%～25%；2分，著色細胞＞25%～50%；3分，著色細胞＞50%～75%；4分，著色細胞＞75%。染色程度評分：0分，基本未染色；1分，弱染色（呈淡黃色）；2分，中等強度染色（呈棕黃色）；3分，強染色（呈棕褐色）。將染色陽性細胞百分比評分與染色程度評分相加，≥4分為陽性，＜4分為陰性。

1.3 Western blotting檢測NSCLC癌組織及癌旁正常組織中IL-9蛋白表達

使用RIPA和1%PMSF提取總蛋白，通過BCA法確定樣品的蛋白質濃度。將組織裂解液在10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，轉移到硝酸纖維素膜上。在室溫下用5%脫脂奶封閉90 min，然后室溫下孵育一抗，包括兔抗人IL-9抗體（ab203386，1∶1 000，英國Abcam公司）和β-actin抗體（ab179467，1∶5 000；英國Abcam公司），在4 ℃下過夜。在室溫下，將辣根過氧化物酶偶聯的二抗IgG抗體應用1 h后檢測。印跡結果分析使用Las-4000 Image軟件和Multi Gauge Ver 3.0軟件（日本富士膠片生命科學公司）。

1.4 統計學分析

應用Prism7.0軟件進行統計分析，計數資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗；正態分布的計量資料采用表示，組間比較采用t檢驗，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學檢測NSCLC癌組織及癌旁組織中IL-9、IL-9R的表達

結果顯示，NSCLC癌組織中IL-9陽性表達88例（80%），其中男性64例，女性24例；IL-9陰性表達22例（20%），男性16例，女性6例。癌旁正常組織中IL-9陽性表達30例（27.3%），陰性80例（72.7%）。癌組織中IL-9的陽性表達率明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義（χ2=61.489，P＜ 0.01），見圖1。NSCLC癌組織中IL-9R陽性表達82例（74.5%），其中，男性60例，女性22例；IL-9R陰性表達28例（25.5%），其中男性20例，女性8例。癌旁組織中IL-9R陽性表達12例（10.9%），陰性表達98例（89.1%）。癌組織中IL-9R陽性表達率明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義（χ2=91.017，P＜ 0.01），見圖2。

圖1 免疫組織化學檢測NSCLC癌組織及癌旁組織IL-9表達×200Fig.1 Immunohistochemical detection of IL-9 expression in cancer tissues and adjacent tissues from NSCLC patients ×200

圖2 免疫組織化學檢測NSCLC癌組織及癌旁組織IL-9R表達 ×200Fig.2 Immunohistochemical detection of IL-9R protein expression in cancer and adjacent tissues from NSCLC patients ×200

2.2 Western blotting檢測NSCLC癌組織及癌旁組織IL-9表達

結果顯示，IL-9蛋白在癌組織中的表達水平（0.63±0.28）較癌旁組織（0.37±0.15）明顯增高（P＜0.05），見圖3。

圖3 Western blotting檢測NSCLC患者癌組織及癌旁組織IL-9蛋白表達Fig.3 IL-9 protein expression in cancer tissues and adjacent tissues from NSCLC patients detected by Western blotting

2.3 NSCLC癌組織中IL9及IL-9R的表達與臨床指標的相關分析

結果顯示，NSCLC癌組織中IL-9的表達與患者性別、年齡、腫瘤分化程度均不相關（均P＞ 0.05），而與腫瘤大小、淋巴結轉移及TNM分期相關（均P＜0.05）。NSCLC癌組織中IL-9R的表達與患者性別、年齡、腫瘤分化程度、腫瘤大小均不相關（均P＞ 0.05），而與淋巴結轉移、TNM分期相關（均P＜ 0.001），發生淋巴結轉移和分期較晚期患者癌組織中IL-9及IL-9R高表達，見表1。

表1 NSCLC癌組織中IL-9及IL-9R表達與患者臨床指標的相關分析Tab.1 Correlation of IL-9 and IL-9R expression with clinical and pathological features

3 討論

IL-9主要由Th9細胞分泌，在支氣管哮喘、自身免疫性疾病中發揮關鍵作用［11-13］。IL-9與IL-9R結合，激活JAK/STAT通路促進炎癥及自身免疫反應［14］。近年來，IL-9在腫瘤免疫中的作用備受關注。最初研究［15］認為IL-9是具有潛在致癌活性的T細胞生長因子，IL-9在非實體腫瘤（多數血液系統腫瘤）中驅動腫瘤生長。有研究［16］發現IL-9可促進彌漫性大B細胞淋巴瘤的細胞存活和耐藥性，同時可促進大細胞間變性淋巴瘤的發生及發展。實體腫瘤研究［17］顯示肝癌組織IL-9、IL-9R表達明顯高于癌旁組織，IL-9、IL-9R顯著促進肝癌細胞增殖、侵襲，抑制細胞凋亡。然而在肺癌實體瘤組織中關于IL-9、IL-9R的研究目前較少，本研究結果顯示，肺癌組織中IL-9的表達明顯高于癌旁正常組織（P＜ 0.05），提示IL-9可能促進NSCLC進展。

IL-9具有復雜的雙重功能，在不同的腫瘤微環境中可以促進或抑制腫瘤細胞的生長和遷移［11］。研究［18］發現Th9細胞分泌的 IL-9對于黑色素瘤的生長有抑制作用，將腫瘤抗原特異性Th1、Th9和 Th17細胞轉移到黑色素瘤小鼠體內，可以明顯抑制黑色素瘤的生長。然而Th9細胞的抗腫瘤作用并不局限在黑色素瘤模型中，在乳腺癌模型中Th9、IL-9表達的增高可通過增強CD8+T細胞介導的細胞毒性發揮抗腫瘤作用［19］。同時也有研究［20］發現Th9細胞在小鼠結腸腺癌模型、肺腺癌模型中也發揮了重要的抗腫瘤作用。但是也有研究［6］發現肺癌惡性胸腔積液中，Th9具有促進肺癌進展和轉移的作用，惡性胸腔積液中存在大量的促炎癥細胞因子，可促進Th9細胞的誘導及分化，其分泌的IL-9通過激活STAT3信號通路促進肺癌細胞的增殖和遷移，抑制γ干擾素對腫瘤細胞的殺傷作用。近期研究［21］發現IL-9可通過增強NSCLC的血管生成促進腫瘤發生。本研究結果顯示IL-9及IL9R表達在NSCLC癌組織較癌旁組織明顯增高，IL-9表達與患者腫瘤大小、淋巴結轉移及TNM分期相關，IL-9R表達與患者TNM分期和淋巴結轉移相關，IL-9及IL-9R在TNM分期較晚及淋巴結轉移患者中高表達，說明IL-9可能通過與IL-9R結合促進NSCLC轉移和進展。

綜上所述，IL-9及IL9R在NSCLC癌組織中高表達，其表達水平與NSCLC的淋巴結轉移以及 TNM 分期相關。因此推測IL-9/IL-9R在NSCLC免疫微環境中起到促癌作用，IL-9/IL-9R可能成為NSCLC調節免疫微環境進行免疫治療的新靶點，但仍需更多的研究進一步來驗證。