鐵超載通過ASK1-p38通路介導的鐵死亡途徑抑制成骨細胞功能

趙恒伍，王文娟，陳勝武

（錦州醫科大學 1.附屬第三醫院骨科，遼寧 錦州 121001；2.附屬第一醫院康復科，遼寧 錦州 121001）

目前，全球人口老齡化日益加重，骨質疏松的發病率也隨之升高。骨質疏松極易導致一系列不良后果和并發癥，甚至出現致殘、致死等嚴重后果［1-2］。鐵作為機體必需的元素，在人體內發揮非常重要的生物學功能，包括參與DNA修復、維持細胞生長、細胞分裂、呼吸作用等生命代謝活動，但是鐵過多也會對人體的細胞和組織產生危害。有臨床研究［3］報道，骨質疏松癥見于多種與鐵超載相關疾病的患者中。實驗研究［4-5］發現，鐵超載可導致成骨細胞功能減弱，干擾干細胞向成骨細胞分化，導致體內骨代謝進一步失衡，從而導致骨質疏松。但是，這一病理過程以及鐵的具體作用和相關機制仍有待于進一步研究。

凋亡信號調節激酶1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）-p38信號通路是一個與鐵離子密切相關的信號轉導途徑，鐵離子的濃度直接影響該信號通路的表達。鐵死亡是近幾年發現的一種新的程序性死亡途徑，是一種全新的細胞死亡模式，在其發生過程中，細胞內脂質氧化物大量累積，攻擊生物大分子，使細胞出現鐵死亡現象。目前已有研究報道，它與多種疾病有關，如癌癥、腎臟疾病、腦損傷性疾病等。這種鐵依賴性細胞死亡形式在生物化學和形態學方面均不同于其他細胞死亡方式［6］，這種現象具有明顯的鐵離子依賴性，但其在成骨細胞中的作用和相關機制未見報道。本研究旨在探討鐵超載條件下成骨細胞功能的變化，并探討ASK1-p38通路介導的鐵死亡機制在這個過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人成骨細胞系hFOB1.19購于中國科學院細胞庫，使用DMEM-F12培養基（美國Sigma-Aldrich公司）加入10%胎牛血清進行培養，培養基中加入1%青鏈霉素（美國Sigma-Aldrich公司）。細胞在33.5 ℃、5% CO2培養箱中進行培養，每2～3 d換1次液。枸櫞酸鐵銨（ferric ammonium citrate，FAC）購于美國Sigma-Aldrich公司；人成骨樣細胞礦化誘導試劑盒購于中國Cyagen公司；成骨細胞茜素紅礦化染色試劑盒購于中國碧云天公司。抗骨保護素（osteoprotegerin，OPG）、抗ASK1、抗p38抗體及其對應磷酸化抗體均購于美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 構建培養體系及不同濃度FAC的干預：人hFOB1.19細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM-F12培養基中，置于34℃、5%CO2的細胞培養箱中培養，0.25%胰酶常規消化傳代［7］。為了探究高鐵環境對成骨細胞的影響，分別設置空白對照組（0 μmol/L FAC）、100 μmol/L FAC組、200 μmol/L FAC組。FAC處理24 h后檢測相關指標。

1.2.2 茜素紅染色測定：hFOB1.19細胞經礦化誘導培養。各組細胞經處理后，應用Cyagen礦化誘導試劑盒進行誘導礦化操作，礦化誘導液內含礦化專用培養基及血清、谷氨酰胺、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松。具體配置方法和各組分濃度按說明書操作，每3 d換液1次，共誘導2～4周。細胞使用4%多聚甲醛固定30 min，根據礦化染色試劑盒（中國碧云天公司）說明書進行染色，然后在倒置光學顯微鏡下觀察染色情況，并且計數10個視野的鈣結節數量。

1.2.3 Western blotting檢測：將收集的細胞在4 ℃下加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制的裂解緩沖液裂解30 min，然后4 ℃、12 000g離心30 min，保留上清液，采用BCA法測定蛋白質濃度。總蛋白提取后，通過12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白（50 μg蛋白質），60 V下將分離的蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜上，用含有5%脫脂乳的封閉緩沖液封閉聚偏二氟乙烯膜2 h。4 ℃下以1∶100～1∶1 000稀釋的一抗孵育過夜，隨后將膜與二抗（抗小鼠、抗兔或抗羊）一起溫育。IgG以1∶6 000或1∶10 000稀釋并與辣根過氧化物酶耦聯，室溫下孵育2 h。用EC3成像系統（美國UVP公司）顯現條帶，應用ImageJ軟件測量條帶的光密度與內參蛋白β-actin的比值。

1.2.4 透射電鏡檢測：各組細胞培養后，使用細胞刮刀小心刮下細胞，800 r/min離心，棄去上清，用2.5%戊二醛固定細胞團塊，乙醇梯度脫水后進行滲透，包埋，切片。將切片用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后置于透射電鏡下觀察。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 FAC降低成骨細胞的成骨功能

為了探究FAC對成骨細胞成骨功能的影響，應用Western blotting檢測成骨細胞中OPG的表達，并應用鈣結節染色測定成骨細胞的礦化能力。結果顯示，FAC抑制成骨細胞OPG的表達，FAC濃度越高，OPG表達越少。FAC抑制成骨細胞的礦化，FAC濃度越高，鈣結節數量越少。結果表明，FAC抑制了成骨細胞的成骨功能。見圖1。

圖1 FAC抑制成骨細胞分化和成骨細胞成骨功能Fig.1 FAC inhibits the differentiation and osteogenic function of osteoblasts

2.2 FAC導致成骨細胞的鐵死亡現象增強

為了探討FAC對成骨細胞鐵死亡現象的影響，檢測FAC干預下成骨細胞的超微結構變化。結果顯示，與空白對照組相比，200 μmol/L FAC干預后成骨細胞內線粒體形態發生明顯改變，線粒體雙層膜密度增加，線粒體內嵴減少或消失，密度降低，符合鐵死亡形態學變化特征。結果表明，FAC可以增強成骨細胞的鐵死亡現象。見圖2。

圖2 FAC干預增強成骨細胞內的鐵死亡現象 ×2 500Fig.2 FAC enhances ferroptosis in osteoblasts ×2 500

2.3 FAC通過激活ASK1/p38通路調控鐵死亡發生

為了探究FAC影響成骨細胞鐵死亡現象的具體分子機制，檢測ASK1和p38通路蛋白的表達。結果顯示，在100 μmol/L和200 μmol/L FAC干預下，ASK1和p38的表達均升高，且與成骨細胞鐵死亡現象一致。結果表明，FAC可以通過調控ASK1-p38信號通路調控成骨細胞鐵死亡。見圖3。

圖3 FAC調控ASK1和p38的表達Fig.3 FAC regulates the expression of ASK1 and p38

3 討論

骨質疏松嚴重影響人類的健康，本課題組的前期研究［7］發現，鐵超載可以刺激成骨細胞的自噬與凋亡，其具體機制可能與二價金屬離子轉運體1有關。鐵作為體內最常見的微量元素之一，對維持機體生命活動具有不可代替的作用。研究證實，機體內鐵離子處于動態平衡中，不斷被吸收、利用、儲存、循環，被稱為鐵穩態。鐵穩態的存在，對細胞的正常生理功能具有重要意義。研究發現，細胞內鐵穩態主要由多種鐵相關蛋白調控，包括細胞內鐵蛋白、二價金屬離子轉運體、轉鐵蛋白受體和轉鐵蛋白等。既往有研究［8］報道，鐵超載可導致小鼠骨質流失，并認為其機制與氧化應激密切相關。還有研究［9］發現，2型糖尿病性骨質疏松的骨組織中成骨細胞出現鐵超載，引起細胞產生氧化應激反應，最終影響成骨細胞的成骨功能，說明2型糖尿病骨質疏松骨組織中存在鐵穩態的失調。以上研究均表明，骨質疏松與鐵離子的穩態密切相關。

2012年研究報道了一種新的程序性死亡途徑，稱之為鐵死亡。與細胞凋亡不同，鐵死亡是依賴鐵離子和活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生的程序性死亡途徑，是一個全新的細胞死亡模式，這種鐵依賴性細胞死亡形式在生物化學和形態學方面不同于凋亡、自噬、壞死、焦亡和其他細胞死亡方式。在其發生過程中，細胞內的谷胱甘肽耗竭，導致谷胱甘肽過氧化物酶4活性受到抑制，脂質氧化物進一步積累，同時過多的鐵離子發生Fenton反應，產生大量ROS，攻擊生物大分子，使細胞出現鐵死亡現象。鐵死亡可能是由特定的誘導物引起的，目前已經發現鐵死亡誘導劑Erastin和RSL3均可以誘導鐵死亡，其特征是細胞內鐵和脂質ROS積累，并在形態學上以線粒體收縮為特征［6］。與這些研究類似，本研究發現FAC刺激同樣可以誘導成骨細胞出現線粒體收縮等鐵死亡特征性表現，同時表現出更低的礦化能力，但受影響的成骨細胞的線粒體形態變化是否嚴格與鐵離子濃度梯度相關仍不清楚，需要進一步設置更多濃度梯度組進行詳細探究。鐵死亡中脂質過氧化的毒性可以被鐵螯合劑（如去鐵胺）或多種親脂原子團（如維生素E、脂肪酶1）等中和。大量研究證實，氧化應激在骨質疏松癥的發病機制中起顯著作用。因此，探討鐵死亡現象在骨質疏松中的具體作用非常有意義，可以為骨質疏松的臨床治療提供新的思路。

哺乳動物中MAPK家族主要包括ERK、p38和JNK等節點。MAPK的激活主要由其上游的MAPK激酶激活，也稱為MAP2K，而在MAP2K的上游還存在十幾種MAPK激酶，被稱為MAP3K。ASK1是近年來才被發現的一個MAPK途徑的上游激酶。研究表明，ASK1可被廣泛的細胞內/外應激激活，如寒冷刺激、內質網應激和紫外線輻射等。最新研究［10］發現，氧化應激也可以激活ASK1，其主要機制是通過抑制硫氧還蛋白的構象轉變。有文獻報道過氧化氫可以通過ASK1途徑誘導細胞死亡，學術界已經公認鐵蓄積會因Fenton反應釋放大量的ROS，這表明ASK1作為p38的上游信號分子，與鐵離子的變化密切相關。本研究發現，高鐵刺激可以激活ASK1磷酸化，進而引起下游p38磷酸化，從而激活這一MAPK相關通路，調控鐵死亡的發生。同時有研究［11］發現，鐵死亡與腦組織、腎臟和心臟組織的病理性細胞死亡相關，鐵死亡可能作為p53下游的內源性腫瘤抑制機制，也可能利用鐵死亡的小分子激活劑選擇性消除Ras-Raf-MEK-ERK通路突變的癌細胞。雖然這個過程仍存在爭議，但是理解這種新的細胞死亡方式如何被調控是非常有意義的。

本研究存在一定的不足，缺少體內實驗的驗證，同時對更多鐵離子濃度梯度以及鐵死亡過程中更深入的機制還有待于進一步的探索，這將是下一步研究的方向。

綜上所述，本研究結果表明，高鐵刺激可以通過激活成骨細胞ASK1-p38信號通路，從而抑制了成骨細胞的功能，并與成骨細胞鐵死亡有關，這些結論為治療骨質疏松提供了思路。