鍉針點按法對缺血性卒中后大鼠大腦皮層腦源性神經生長因子的影響

楊 康，胡冠宇，王宇峰，謝東伶，叢德毓*

（1.長春中醫藥大學針灸推拿學院，長春 130117；2.長春中醫藥大學附屬醫院 針灸推拿科，長春 130021）

缺血性腦卒中（ischemic stroke,AIS）是由腦部缺血缺氧引發一系列缺血性級聯反應所導致的一種具有高發病率且發病機制十分復雜的難治性疾病[1]，約占全部卒中的80%[2]。其在我國死亡率居高不下，僅次于惡性腫瘤[3]。不僅如此，缺血性腦卒中的高復發率及年輕化態勢更是讓研究者們面臨著嚴峻挑戰。腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）不僅能夠促進腦損傷后神經功能和運動功能的恢復，而且參與營養和保護中樞神經系統的發育。卒中后腦缺血導致腦源性神經生長因子分泌減少，神經功能恢復受到抑制。現代醫學證實，推拿點按手法可改善大腦及四肢的血液循環，促進腦源性神經生長因子的表達。本研究旨在觀察鍉針點按干預方法對腦源性神經生長因子在缺血性卒中后大鼠腦組織中表達的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 武漢三鷹生物技術有限公司提供BDNF 抗體，貨號：28205-1-ap，分子量28-30KD，種屬：Rabbit，一抗稀釋比：1:1 000，二抗稀釋比：1:5 000，鍉針全長17 cm，針頭直徑4 mm，北京中研太和醫療器械有限公司提供。

1.2 實驗動物 雄性SPF 級SD（Sprague-Dawley）大鼠24 只，體質量280～300 g，許可證號：SCXK（吉）·2018-007。自由飲水與進食，適應環境飼養1周后進行試驗。

1.3 動物模型 采用線栓法建立大鼠局灶性永久性腦缺血模型[4]。大鼠麻醉后仰臥固定，頸部正中縱行切口后暴露左側頸總動脈（common carotid artery，CCA）、頸外動脈（external carotid artery，ECA）和頸內動脈（internal carotid artery，ICA），分離迷走神經，在近心端結扎CCA、ECA，將線栓在距離CCA 分叉處4 mm 切一小口輕插入ICA 約18 mm，將繞在ICA遠端的細線扎緊，最后將CCA遠端的細線扎緊并縫合。假手術組僅剝離皮下肌肉組織。手術后用Zea Longa 評分評價造模是否成功。

1.4 干預方法 大鼠根據李忠仁主編的《實驗針灸學》[5]進行固定，假手術組和模型組僅抓取、固定，治療組將壓力傳感器接頭置于大鼠頭部頂顳前斜線上，手持鍉針進行垂直點按，力度控制在5 N 左右，停留5 s，間隔3 s，每次10 min，每天1次，時間均連續2 周。

1.5 腦神經功能評價 根據Zea Longa 評分標準[6]：0 分為無神經損傷癥狀；1 分為無法完全伸展對側前爪或后爪；行走時向手術對側轉圈為2 分；3 分為行走時向手術對側傾倒；4 分為不能自發行走，意識喪失。分別在造模后及治療結束后各評分1 次。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 HE 染色 神經功能評分測試后，各組隨機抓取2只大鼠，10%水合氯醛（0.35 mL/ 100 g）腹腔注射麻醉，灌注后整個大腦被迅速取出并儲存于4%多聚甲醛中24～48 h；取中央前回2 mm 的左側大腦皮層組織，固定、脫水、石蠟包埋，連續切4 μm 薄片，60 ℃烤片2h 備用。

1.6.2 TTC 染色 2 周后，取腦組織，冠狀切片，加入1%2，3，5-三苯基四氮唑的磷酸緩沖液，計算腦梗死面積。腦梗死面積=（白色的梗死面積/片子的總面積）×100%。

1.6.3 Western Blot、Q-PCR 檢測各組大鼠腦組織皮層BDNF、BDNFmRNA 表達變化 2 周后，斷頭處死各組剩余4 只大鼠，梗死側皮質在冰盤上迅速取出，液氮速凍，-80 ℃保存，等待檢測BDNFmRNA及蛋白表達。

1.7 統計學方法 統計軟件采用SPSS 19.0進行分析，計量資料以均數±標準差（）表示，t檢驗比較組間差異，計數資料以n（%）表示。統計圖用Graph Pad prism 6 軟件繪制。

2 結果

2.1 組間神經功能評分比較 見表1。

表1 組間神經功能評分比較（，n=8）

表1 組間神經功能評分比較（，n=8）

注：與假手術組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜ 0.05

2.2 組間腦梗死面積比較 見表2，圖1。

表2 組間腦梗死面積比較（，n=8）

表2 組間腦梗死面積比較（，n=8）

注：與假手術組比較，# P ＜ 0.05；與模型組比較，△P ＜ 0.05

2.3 組間腦組織病理學形態比較 見圖2。與模型組相比較，腦組織結構在假手術組與治療組相對完整，細胞形態較正常，增殖明顯，而腦組織在模型組結構疏松，腦膜不完整，神經元細胞形狀不規則，胞核固縮深染，可見大量不規則空洞。

圖2 各組大鼠腦組織病理學形態比較

2.4 組間BDNF 蛋白水平比較 見表3，圖3。

表3 組間BDNF 蛋白水平比較（，n=8）

表3 組間BDNF 蛋白水平比較（，n=8）

注：與假手術組比較，# P ＜ 0.05；與模型組比較，△P ＜ 0.05

圖3 各組大鼠BDNF 蛋白水平比較

2.5 組間BDNF mRNA 水平比較 見表4。

表4 組間BDNF mRNA 水平比較（，n=8）

表4 組間BDNF mRNA 水平比較（，n=8）

注：與假手術組比較，# P ＜ 0.05；與模型組比較，△P ＜ 0.05

3 討論

卒中發病突然，我國腦卒中發病率據2019 年全球疾病負擔研究數據顯示為39.9%[7]，缺血性卒中發生發展過程中，腦組織局部血流供應受阻，缺血、缺氧導致神經元細胞凋亡或發生不可逆壞死，這是造成中風患者神經功能障礙的主要病理基礎。大量研究表明，海馬和皮層中高表達腦源性神經生長因子[8]，腦源性神經生長因子及其下游通路可促進受損神經的神經元生長、發育、分化、軸突樹突生長、調節突觸可塑性以及再生修復等[9]。此外，缺血性卒中后腦組織一氧化氮合酶能被腦源性神經營養因子抑制，從而減輕神經元遭受自由基的損傷程度[10]。

在缺血缺氧腦病病程早期，腦源性神經生長因子可通過影響轉錄因子結合DNA 的活性或激活特定的信號轉導通路來保護神經元免受氧化應激損傷，隨著缺血缺氧腦病的進展，會引起腦神經發育障礙，進而對腦源性神經生長因子的表達和分泌造成不利影響，導致嚴重的神經元損傷[11-12]。

《內經》曰：“其有三虛而偏于邪風，則為擊仆偏枯矣”，首次提出腦梗死這一病名，在《醫學綱目》中，首次出現卒中這一病名的描述癥狀以突然昏倒，不省人事，口舌渦斜，半身不遂，言語蹇澀為主，與腦梗死癥狀相似。虛、火、風、痰、氣、血在現代醫學中認為是中風的主要病因病機，本虛標實貫穿疾病始終。頭部腧穴治療腦梗死，《靈樞·五亂》曰：“氣亂頭則為逆，蘇醒免災危”，是對頭部相關腧穴治療中風的早期描述，《靈樞·熱病》曰：“偏枯，身偏不用而痛……益其不足，損其有余”，界定中風病的實則瀉之，虛則補之的治療原則。

《靈樞·九針十二原》：“鍉針，長三寸半。”[13]《內經》記載其起源于夏、商、周時代，到了春秋戰國時期基本發展成型[14]。《針灸集成·制九針法》曰：“脈氣虛少宜鍉針。”是對鍉針的用途作進一步注釋。《靈樞·官針第七》載：“三者人也，人之所以成生者血脈也。”[15]古人將鍉針比作人部，人體的生命活動皆有賴于血脈的濡養，鍉針尖圓潤，不傷血脈，用以疏通脈痹正宜。

“頭為諸陽之會，元神之府”，解剖上，中醫認為“腦為髓之海”，頭部點按區域正好位于腦缺血病灶附近，對于腦梗死的治療更為直接；生理上，“百脈之氣皆歸于頭”，全身經脈血氣都匯聚于頭腦空竅，針刺或點按頭部腧穴功能區可通過神經、血管、內分泌等機制間接作用到梗死的腦組織，從而發揮快速有效的治療作用，如王順等[16]認為頭針起效的主要機制是頭針可以誘發顱內相應皮質區產生動態電位（MEP）。吳緒平等[17]研究表明，頭穴透刺可減輕腦缺血患者腦水腫程度，主要是通過降低腦內β-內啡肽含量，對病灶區腦組織起到治療作用。于氏[18]認為人體一身之經絡皆匯聚于頭部，刺激特定的頭皮區域既能調理經絡氣血，又能直接作用于病損皮層，改善微循環，提高供血供氧，這種刺激可改善缺血性半暗帶區域腦組織神經元缺血缺氧的狀態[19]。

《頭皮針穴名國際標準化方案》通過后，很多學者致力于頭針的機理機制研究[20]。頂顳前斜線在生理解剖結構上，又與大腦中央前回相對應，而此區功能又與肢體痙攣的治療相對應，故點按此區域，刺激頭皮可以直接作用于其下的大腦皮層，能夠激活Trk B信號傳導，腦源性神經生長因子聯合Trk B 等保護神經元，減輕神經元損傷。

基于國醫大師任繼學和石學敏院士的學術思想，從“腦損絡傷”的病機出發，故以鍉針點按頭部頂顳前斜線功能區為主，通脈活血、補益臟腑、平衡陰陽，進而起到調暢全身陰陽經脈氣血的作用，使得筋脈自柔的同時又能補瀉經氣，促進中風后恢復。

本研究結果表明：鍉針點按治療在腦缺血模型大鼠的神經功能評分、腦梗死面積、腦源性神經生長因子蛋白和mRNA 含量方面有顯著作用（P＜0.05）。