HIF-1α對人結直腸癌細胞裸小鼠成瘤性的影響

楊 寶，王 婧，陳 超，周 潔，李 海

1.寧夏醫科大學總醫院結直腸外科，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫科大學總醫院內分泌科，寧夏 銀川 750004；3.江蘇省人民醫院普外科，江蘇 南京210029

隨著中國人生活水平的不斷提高，老年患者中結直腸腫瘤的發病率也呈逐年升高趨勢。目前對于中晚期結直腸癌患者尚無統一有效的治療方法，探索影響結直腸腫瘤發生、發展的因子，有利于提高老年患者的治療效果及生存率。缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）因其在腫瘤發生、發展過程中的關鍵作用，成為研究熱點。之前研究［1］表明，HIF-1α也會影響結直腸腫瘤的發生、發展。腫瘤細胞惡性增殖數量短時間內激增，血管供氧不足，造成局部缺氧環境，而有研究［1］發現，HIF-1α在這種缺氧環境中表達異常增高。HIF-1α可以誘導血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，ⅤEGF）的產生，為腫瘤的增殖提供充足的營養物質［2］。而在這些研究中，大部分僅局限于體外細胞實驗來證明HIF-1α在腫瘤中的作用。本文通過裸小鼠移植瘤實驗，將人結腸癌HCT116細胞注入到裸小鼠體內，來探討HIF-1α對結直腸腫瘤細胞成瘤性的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

HCT116細胞購自美國模式培養物保藏所（American Type Culture Collection，ATCC），BALB/c裸小鼠（雄）30只購自寧夏醫科大學動物實驗中心，Annexin Ⅴ-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細胞凋亡檢測試劑盒購自甘肅海基生物科技有限公司，McCoy’s 5A培養基購自美國Gibco公司，兔多克隆抗體（HIF-1α）購自美國Abcam公司，HRP標記山羊抗兔IgG抗體購自美國Proteintech公司，反轉錄試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞的復蘇與培養

HCT116細胞保存在液氮罐中，取出后馬上37 ℃水浴鍋中復蘇，待凍存管中液體完全溶解后，在超凈工作臺無菌條件下將細胞移至5 mL離心管中。1 000 r/min離心5 min后棄上清液，加入適量培養基充分吹打混勻后轉入含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、2.5%青霉素、2.5%鏈霉素的McCoy’s 5A培養基中，然后放至37 ℃、CO2體積分數為5%的細胞培養箱中培養。2～3 d換液1次，細胞貼壁長至80%～90%后傳代1次。

1.2.2 細胞轉染

HCT116細胞培養至對數生長期，加入適量胰酶消化數分鐘，待細胞脫壁后加入含FBS的培養基終止胰酶消化，充分吹打后將細胞移至5 mL離心管中離心。重懸細胞并計數，取1×105個細胞接種至6孔板中，置于37 ℃、CO2體積分數為5%的細胞培養箱中培養。24 h后根據使用說明加入病毒，放至培養箱中繼續溫育12 h后吸棄上層轉染液，加入含10%FBS的McCoy’s 5A培養基培養。si-HIF-1α由上海吉凱基因醫學科技股份有限公司合成。si-HIF-1α序列：5’-CTGATGACCAGCAACTTGA-3’。

1.2.3 蛋白質印跡法（Western blot）檢測蛋白的水平

細胞培養至對數生長期后，使用全蛋白提取試劑盒提取細胞蛋白，BCA法蛋白定量后，100 Ⅴ電壓下行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）1 h，轉膜后TBST封閉1 h，加入HIF-1α抗體，4 ℃溫育過夜，TBST洗膜3次，加入二抗后室溫下溫育1 h，TBST洗膜3次，采用電化學發光（electrochemical luminescence，ECL）法顯影。條帶結果灰度值使用Image J軟件進行分析，結果計算目的蛋白灰度值與相應內參灰度值之比，取平均值。

1.2.4 反轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）檢測mRNA的表達

細胞培養至對數生長期，提取細胞RNA并反轉錄為cDNA，以cDNA為模板行RT-PCR檢測各組細胞HIF-1α mRNA的表達情況。RT-PCR條件：98 ℃預變性30 s；98 ℃變性10 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，共40個循環；4 ℃保存。計算公式：ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組，RQ=2-ΔΔCt，將對照組目的基因mRNA相對水平作為1。

1.2.5 Annexin Ⅴ-FITC/PI流式細胞術檢測細胞凋亡

將細胞以2 000 r/min懸浮離心5 min，收集細胞。然后PBS洗滌，離心細胞2次（2 000 r/min，5 min），收集1～5×105個細胞。分別加入500 μL的結合緩沖液懸浮細胞，5 μL Annexin Ⅴ-FITC混勻細胞，5 μL PI再次混勻細胞后，室溫、避光反應5～15 min，采用流式細胞術檢測。

1.2.6 裸小鼠移植瘤實驗

1.2.6.1 裸小鼠的飼養

裸小鼠在無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級環境下進行飼養。裸小鼠分為3組：空白對照組、實驗組和陰性對照組，分別注射對應組別的細胞，每組裸小鼠10只。飼料及飲用水須滅菌，控制裸小鼠飼養環境的溫度、氧氣、濕度恒定。當裸小鼠生長至8周齡后進行實驗。

1.2.6.2 移植瘤模型的建立

3組細胞制成懸液，用潔凈1.5 mL Ependorf試管保存置于冰上，然后將懸液與基質膠混勻迅速接種。每只裸小鼠在右前肢背部的皮下注射約2×106個細胞。接種后觀察裸小鼠腫瘤形成及生長情況，飼養方式不變，在接種約1周后判斷是否成瘤，每周測量裸小鼠瘤體的體積（體積=1/2×長×寬2）［3］。瘤體形成、生長4周后，裸小鼠麻醉后處死，取出裸小鼠皮下瘤體稱重。將取出的瘤體放入凍存管標記后迅速投入到液氮中貯存。

1.3 統計學處理

用SPSS 22.0統計軟件對實驗數據進行分析。數據均采用表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOⅤA），并用t檢驗進行組間兩兩比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Western blot和RT-PCR檢測細胞轉染后HIF-1α的蛋白和mRNA水平

采用RNA干擾技術下調HIF-1α的表達，并通過鏡下觀察細胞內綠色熒光強度以判斷轉染質粒在細胞內的穩定表達。在Western blot實驗中，空白對照組（PBS組）、si-NC組及si-HIF-1α組中HIF-1α蛋白的相對表達量分別為0.85±0.06、0.79±0.07和0.37±0.08。空白對照組（PBS組）的HIF-1α蛋白相對表達量與si-NC組相比差異無統計學意義，si-HIF-1α組的HIF-1α蛋白相對表達量與空白對照組（PBS組）相比顯著降低（t=3.82，P＜0.01），與si-NC組相比也顯著降低（t=4.89，P＜0.01），表明轉染si-HIF-1α可特異性降低細胞內HIF-1α蛋白表達量，沉默效率為56.5%。RT-PCR實驗中，空白對照組（PBS組）、si-NC組及si-HIF-1α組的HIF-1αmRNA相對表達量分別為5.95±1.36、5.71±1.22和1.74±0.42。空白對照組（PBS組）的HIF-1αmRNA相對表達量與si-NC組相比差異無統計學意義，si-HIF-1α組的HIF-1αmRNA相對表達量與空白對照組（PBS組）相比顯著降低（t=4.64，P＜0.01），與si-NC組相比也顯著降低（t=3.71，P＜0.01），沉默效率為70.8%。通過Western blot和RT-PCR的檢測證明，細胞轉染成功，HIF-1α的表達顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 細胞轉染后HIF-1α的表達水平Fig.1 Expression level of HIF-1 α after transfection

2.2 Annexin Ⅴ-FITC/PI流式細胞術檢測細胞凋亡情況

采用流式細胞術對細胞凋亡情況進行檢測，結果表明，空白對照組凋亡率為1.3%±0.7%，實驗組為11.1%±1.6%，與空白對照組相比顯著升高（P＜0.001），陰性對照組凋亡率為3.5%±0.8%，與空白對照組相比未顯著升高（P＞0.05，圖2）。

圖2 Annexin Ⅴ-FITC/PI流式細胞術檢測各組細胞凋亡Fig.2 Apoptosis was detected by Annexin Ⅴ-FITC/PI flow cytometry in each group

2.3 裸小鼠移植瘤實驗

2.3.1 裸小鼠成瘤情況

裸小鼠接種1周后觀察各組成瘤情況，空白對照組與陰性對照組中10只裸小鼠全部成瘤；實驗組中9只成瘤，1只未成瘤。前期裸小鼠精神尚可，后期精神萎靡、納差，在此期間未見死亡裸小鼠（表1）。

表1 裸小鼠成瘤情況Tab.1 Tumorigenesis in nude mice

2.3.2 瘤體體積的變化

在瘤體形成后，連續4周對瘤體的體積進行測量，得到瘤體體積（表2），并繪制生長曲線圖（圖3）。將每周的瘤體測量值比較后可以看到，與空白對照組相比，實驗組的瘤體體積增加較為緩慢，差異有統計學意義（P＜0.05）；而陰性對照組與空白對照組差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 每周的瘤體體積Tab.2 Tumor volume per week()

表2 每周的瘤體體積Tab.2 Tumor volume per week()

圖3 瘤體生長曲線圖Fig.3 Growth curve of tumor

2.3.3 瘤體質量的比較

裸小鼠成瘤4周后，裸小鼠麻醉處死后取瘤體稱重。得出各組的瘤體質量（表3），并繪制瘤體質量半定量分析圖（圖4）。與空白對照組相比，實驗組的瘤體質量較低（P＜0.05）；而陰性對照組的瘤體質量與空白對照組差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組的瘤體質量Tab.3 Tumor weight in each group()

表3 各組的瘤體質量Tab.3 Tumor weight in each group()

圖4 各組的瘤體質量比較Fig.4 Comparison of tumor weight in each group

3 討論

HIF-1α是治療腫瘤的關鍵靶點，目前已經得到許多研究者的證實［4］。在結直腸腫瘤發生、發展的過程中，HIF-1α的表達水平異常增高，可以激活基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）、ⅤEGF和上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關因子等，使腫瘤細胞獲得增殖、遷移和侵襲的能力［5-7］。體外細胞學實驗［2］已經揭示了其發揮功能的相關機制。而本研究通過體內實驗來探討HIF-1α在結直腸腫瘤發生、發展過程中的作用，本研究成功構建了細胞和裸小鼠的相關模型，通過比較分析，探討HIF-1α在結直腸腫瘤的作用。

裸小鼠致瘤實驗結果顯示，與空白對照組相比，實驗組中裸小鼠瘤體的體積增加較慢，瘤體質量較低，而陰性對照組與空白對照組差異無統計學意義。這些研究結果表明，下調HIF-1α在結直腸腫瘤中的表達，能夠有效抑制瘤體的增殖，這與體外細胞學研究結果是一致的，提示HIF-1α在結直腸腫瘤的發生、發展過程中發揮重要作用。當瘤體內HIF-1α表達水平降低時，其下游因子MMP和ⅤEGF的表達受到抑制。ⅤEGF作為一種生長因子，具有高度特異性［8］，能夠增加血管通透性，促進細胞外基質變性，促進血管內皮細胞遷移、增殖和血管形成等作用［9-11］。MMP家族如MMP2，能夠將細胞外基質（extracellular matrix，ECM）中的蛋白成分降解，使得能夠阻滯腫瘤細胞侵襲的組織屏障受到破壞，并且使細胞的黏附力得到增強，從而增強腫瘤細胞的侵襲能力［12］。而且MMP2還能促進合成和釋放多種能夠調控血管生長的因子（如ⅤEGF等），促進血管生成，激發潛在的生物活性［13］。在正常腫瘤生長低氧環境下，ⅤEGF能夠調節血漿酶原活化因子和血漿酶原活化因子抑制因子-l的mRNA水平升高，從而增強血漿酶原活化因子的生物活性，促進細胞外蛋白的水解，進而催生新的毛細血管［14］。因而一旦ⅤEGF的活性受到抑制，不能為腫瘤的生長形成新生血管，就會導致腫瘤增殖障礙。本研究實驗組中的1只裸小鼠成瘤失敗可能與上述原因相關。

綜上所述，結直腸腫瘤中HIF-1α的下調可以抑制瘤體的生長，促進其凋亡。本文為HIF-1α作為癌癥治療的靶點提供了體內實驗的依據。