響應面法優化三氯化鐵回收河鲀魚糜漂洗液中蛋白質的研究

劉淑集，黃珊紅，陳曉婷，陳 貝，許 旻，蘇永昌，劉智禹*

[1.福建省水產研究所，國家海水魚類加工技術研發分中心(廈門)，福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室，福建省海洋生物資源開發利用協同創新中心，福建 廈門 361013；2.廈門海洋職業技術學院，福建 廈門 361100]

將魚經過采肉、漂洗、精濾、脫水攪拌及凍結加工得到魚糜[1]，再將魚糜經過擂潰(斬拌)、成型、加熱和冷卻工序制成魚糜制品[2]。漂洗是魚糜加工過程中的關鍵工藝[3]，但魚糜在經過漂洗的過程中會產生廢液，漂洗廢液直接排放會導致水質受到嚴重污染。而且魚肉中30%～40%蛋白質以不溶性的魚糜微粒和水溶性的形式存在于魚糜漂洗液中，隨著漂洗液的丟棄而流失，造成了蛋白質的浪費。經研究表明，魚糜漂洗液回收蛋白質中氨基酸種類齊全，并且比例均衡，符合FAO/WHO推薦的理想蛋白質模式，是理想的優質蛋白質[4]。回收這部分的魚糜漂洗液不僅能減少環境污染，降低廢水處理費用，還能在很大程度上增加企業潛在的利潤。因此，如何回收魚糜漂洗液中的水溶性蛋白質成為人們關注的焦點。回收魚糜漂洗液的方法主要有絮凝法[5]、超濾法、等電點沉淀法[6]和離子交換法[7]等。但這些方法各有利弊，無法同時滿足回收率、操作簡便、成本低廉等要求。

三氯化鐵(FeCl3)是一種蛋白質絮凝劑，可使蛋白質聚沉而進行回收。它易溶于水，具有絮凝速度快、安全無毒、成本低等優點，已被廣泛應用于食品、造紙、化工、煤礦、環境保護等領域中的廢水處理[8]。孫紅杰等[9]采用8 mg/mL的FeCl3絮凝地下水，發現當pH>6時，主要絮凝機理是以氫氧化鐵[Fe(OH)3]的網捕卷掃為主；當pH<4時，主要絮凝機理是Fe3+以壓縮雙電層為主。因此，本研究擬開展FeCl3法回收魚糜漂洗液中蛋白質工藝的研究與優化，以期應用于魚糜加工過程中漂洗液廢水的處理，回收蛋白質，變廢為寶，提高魚糜加工的附加值。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及設備

試驗材料：河鲀，購自福建省鲀之鮮水產有限公司。魚糜漂洗液：將河鲀魚肉進行斬拌2 min；水的溫度保持在10℃，水和魚糜的比例為7∶1，配好水和魚糜的比例后開始進行漂洗，分3次漂洗，一次3 min；漂洗后靜置3 min以上，倒出漂洗液，儲存。

試驗試劑：三氯化鐵(FeCl3)，購自國藥集團化學試劑有限公司；Pierce BCA Protein Assay Kit BCA蛋白質含量檢測試劑盒，購自美國Thermofisher公司。

試驗儀器：pH計、斬拌機、恒溫水浴鍋、臺式離心機、恒溫振蕩器、M200PRO酶標儀。

1.2 試驗方法

工藝流程：在10 mL魚糜漂洗液中加入一定量的FeCl3溶液，調節一定的pH，放置在一定溫度的水浴鍋保溫一定時間，4 000 r/min離心10 min。取上清液25 μL和BCA試劑200 μL混合于酶標板上，放置在37℃恒溫振蕩器震蕩30 min。通過酶標儀測定562 nm的OD值，繪制標準曲線，計算蛋白質含量。

1.2.1 單因素試驗法

以蛋白質回收率(Rate of protein recovery，RPR)為指標，在固定其他影響因素保持不變的狀態下，分別考察1% FeCl3溶液添加量(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL)、pH(3、5、7、9、11)、回收溫度(25、45、55、65、75℃)、回收時間(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h)對蛋白質回收效果的影響，每個水平試驗重復3次。

1.2.2 蛋白質回收率的測定

蛋白質回收率=[1-(絮凝后上清液中蛋白質含量/魚糜漂洗液原液中蛋白質含量)]×100%

1.2.3 響應面優化FeCl3法回收蛋白質的工藝條件

在單因素試驗結果的基礎上，根據Box-Benhnken中心組合設計原理[10]，選取pH(X1)、回收溫度(Temperature，T)(X2)與1% FeCl3溶液添加量(Addition of 1% FeCl3solution，AFS)(X3)3個因素作為自變量，以蛋白質回收率(Y)作為響應值，在pH(3、5、7)、回收溫度時間(60、65、70℃)和1% FeCl3溶液用量(1.0、1.5、2.0 mL)3因素3水平上對FeCl3法回收蛋白質進行響應面優化，并進行驗證。

1.3 數據分析處理

2 結果與分析

2.1 各單因素對FeCl3法回收蛋白質的影響

2.1.1 FeCl3溶液添加量對蛋白質回收率的影響

FeCl3溶液添加量對回收魚糜漂洗液中的蛋白質有明顯的影響，結果見圖1。在pH 7、回收溫度55℃和回收時間3 h的條件下，隨著FeCl3溶液添加量的增加，蛋白質回收率隨之快速增加，這是由于Fe(OH)3的吸附作用引起的。所以，當漂洗液中蛋白質濃度較高時，需要的FeCl3濃度相對較高，說明FeCl3的用量和漂洗液蛋白質的濃度存在一定的正相關關系[11]。當1% FeCl3溶液添加量超過1.5 mL時，蛋白質回收率增加的趨勢變慢，因此，選擇FeCl3溶液的添加量為1.5 mL，此時蛋白質回收率為75.33%。

2.1.2 pH對蛋白質回收率的影響

pH對魚糜漂洗液中蛋白質回收效果的影響如圖2所示。在回收溫度55℃、回收時間3 h和1% FeCl3溶液添加量為1.5 mL的條件下，隨著pH的增加，漂洗液中蛋白質的回收率越來越高，當pH為5時，回收率最高，為58.29%。之后隨著pH的升高，蛋白質的回收率逐漸下降。在弱酸性范圍內，隨著pH的升高，水解作用增強。當pH達到5～6時，Fe3+轉化為Fe(OH)3膠體，該膠體具有較強的吸附架橋和吸附電中和功能，使蛋白質能夠得到最大程度的凝聚。但繼續增大pH，絮凝作用減弱，導致蛋白質回收率下降[12]。因此，選擇pH 5作為后續優化的條件。

2.1.3 回收溫度對蛋白質回收率的影響

回收溫度對FeCl3法回收魚糜漂洗液中的蛋白質有明顯的影響，結果如圖3所示，在pH 7、回收時間3 h和1% FeCl3溶液添加量為1.5%的條件下，隨著回收溫度的升高，蛋白質回收率逐漸增高。當溫度達65℃時，蛋白質的回收率最高，為88.39%。當繼續提高溫度，蛋白質回收率反而下降，這可能是因為高溫使蛋白質失去活性，造成蛋白質脫附，導致回收率下降[13-14]。因此，回收溫度選擇65℃為宜。

2.1.4 回收時間對蛋白質回收率的影響

在pH 7、回收溫度55℃和1% FeCl3溶液添加量為1.5 mL的條件下，回收時間對FeCl3回收魚糜漂洗液中的蛋白質的影響較小，結果如圖4所示。Fe3+在很短的時間內能夠轉化為Fe(OH)3膠體。回收1 h時蛋白質的回收率達60.22%，4 h 時回收率增加到61.99%，增加緩慢，此后繼續延長時間，蛋白質回收率幾乎呈穩定狀態。所以選取的回收時間為4 h。

2.2 響應面試驗結果

對各單因素數據進行組間的顯著性分析[15]發現，pH、回收溫度、1%FeCl3溶液添加量和回收時間4個因素在設定的水平之間的限制差異P值分別0、0、0、0.452，其中回收時間對蛋白質回收率沒有顯著影響，所以選擇pH(pH/X1)、回收溫度(T/X2)和1%FeCl3溶液添加量(AFS/X3)為自變量，以蛋白質回收率(RPR/Y)為因變量，應用Design-Expert 8.0軟件，進行3因素3水平的魚糜漂洗液回收工藝優化，試驗結果如表1所示。

表1 響應面試驗設計方案與結果

從表1的試驗數據，可以看出在不同pH、回收溫度和1%FeCl3溶液添加量的影響下，蛋白質回收率各不相同。1%FeCl3溶液添加量在1.5～2.0 mL、回收溫度在60～65℃、pH在5～7時，蛋白質回收率達到最高值。

根據Box Behnken試驗設計進行了17組試驗，得到二次多項式擬合方程為：

Y=93.21+9.40X1+1.37X2-3.39X3+1.62X1X2+5.51X1X3-0.33X2X3-8.71X12-12.39X22-10.64X32。

根據二次模型的方差分析結果(表2)，Y方程回歸模型的P值為0.035 2(<0.05)，說明模型達到顯著水平，失擬項P值為0.055 4，失擬不顯著，說明方程擬合良好，回歸方程式具有可靠性。

表2 蛋白質回收率二次回歸方程方差分析結果

續表2

由表1和表2可以看出，各響應因素影響程度：X1>X3>X2，即回收時pH對蛋白質的回收率影響最大。

3個因素對蛋白質回收率影響交互作用的響應面結果如圖5所示。隨著pH、溫度和1%FeCl3溶液添加量的增加，蛋白質的回收率先升高后下降，3個因素的兩兩交互曲面整體呈現凸起，為倒“U”形，等高線呈橢圓形，說明3個因素兩兩間存在一定的交互作用。

利用Design-Expert 8.0軟件對響應面結果進行最優化分析，以蛋白回收率為評價指標，確定回收魚糜漂洗液的最優工藝為溫度65.44℃、pH 5.94、1% FeCl3溶液添加量1.37 mL，此時蛋白回收率達到最大值，為(96.47±0.953)%。為操作便利，將此條件調整為溫度65℃、pH 6、1% FeCl3添加量1.4 mL，并進行3次重復試驗，計算蛋白質的回收率為95.14%，與模型預測值沒有顯著性差異，說明響應面法得到的回歸模型具有一定的可靠性。

3 結論

在單因素試驗的基礎上，得出的試驗結果是在pH為5～6、溫度為55～65℃、1%FeCl3溶液添加量為1.5～2.0 mL時，蛋白質回收率較高，達88.49%。通過響應面法進行數值優化，得到試驗結果為10 mL魚糜漂洗液在溫度65℃、pH 6、1% FeCl3溶液添加量為1.4 mL時，蛋白回收率達到95.14%。獲得的FeCl3法回收魚糜漂洗液中的蛋白質優化工藝，可進行放大并被應用于魚糜生產企業；回收的蛋白質可作為蛋白質補充劑添加在魚粉、飼料中，有助于企業充分利用魚糜漂洗液的蛋白質，提高魚糜加工的附加值，減少排放漂洗液帶來的環境污染，降低污水處理成本，具有一定的經濟效益。