甘藍型油菜BnFAD2基因的生物信息學分析

陳 鎮(zhèn)，何曉瑩，王敬喬，李根澤，束正齊，趙凱琴，程小毛，俎 峰

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所，昆明 650225；2.西南林業(yè)大學園林園藝學院∕國家林業(yè)與草原局西南風景園林工程技術(shù)研究中心，昆明 650224）

甘藍型油菜（Brassica napusL.，2n=38，AACC）是中國重要的油料作物，菜子油是中國第一大食用油，占國產(chǎn)植物油的47%。隨著人均生活水平的進一步提升，大眾對菜子油品質(zhì)有了更高的要求［1，2］。菜子油的高品質(zhì)主要由單不飽和油酸（C18∶1）和2種多不飽和亞油酸（C18∶2）、亞麻酸（C18∶3）組成的脂肪酸決定。高濃度的亞油酸、亞麻酸會影響油脂的穩(wěn)定性和營養(yǎng)價值［3］，而較高含量的油酸可提升種子與油的氧化穩(wěn)定性，延長保質(zhì)期。此外，油酸是一種不飽和脂肪酸，其營養(yǎng)價值高，對人體心血管健康有良好作用［4-6］。因而選育高油酸的雙低油菜品種是當前油菜品質(zhì)改良的重要目標之一。

在植物中，不飽和脂肪酸的形成需要復雜多酶復合體的催化，其合成主要分為兩個過程：初步合成以及進一步去飽和。首先是在質(zhì)體中生成不同鏈長的飽和脂肪酸，如十八碳飽和脂肪酸-硬脂酸（18∶0）在硬脂酰-ACP去飽和酶（Stearoyl-ACP desaturase，SAD）的催化作用下生成單不飽和脂肪酸-油酸（18∶1），隨后油酸在油酸脫氫酶（FattyAcid Desaturase 2，F(xiàn)AD2）的催化作用下生成多不飽和脂肪酸-亞油酸，這是產(chǎn)生多聚不飽和脂肪酸的關(guān)鍵步驟［7-9］。由此可見基因FAD2可能是調(diào)控油酸與亞油酸含量比例的關(guān)鍵因子。自1994年，Okuley等［10］在擬南芥中發(fā)現(xiàn)油酸脫氫酶主要由FAD2基因控制，隨后研究人員相繼在花生［11］、大豆［12］、油菜［13］和玉米［14，15］等油料作物以及油桐［16］、橄欖［17］等油料樹種中克隆到了FAD2基因。在對控制油菜油酸和亞油酸含量基因進行定位的研究中，學者發(fā)現(xiàn)控制高油酸性狀的主要基因是FAD2基因的1個功能拷貝，位于N5連鎖群上，該基因的突變能影響脂肪酸含量［18］；進一步通過QTL定位以及分子克隆研究發(fā)現(xiàn)，在甘藍型油菜中FAD2基因有4個拷貝，且該基因位于A5染色體上［19］，C5染色體上也存在基因表達的調(diào)控區(qū)［20，21］，這是控制油酸含量的主要因子。此外Zhao等［22］在甘藍型油菜A9染色體上鑒定出一個新的控制油酸含量的QTL位點，結(jié)合FAD2突變等位基因能將油酸含量提高至80%左右。在花生中鑒定與含油量相關(guān)QTL中，發(fā)現(xiàn)FAD2基因?qū)φ{(diào)控油酸、亞油酸含量及油酸與亞油酸含量之比具有顯著作用，而對總含油量沒有影響［11］。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，在不同種植物中FAD2基因功能也得到相應(yīng)驗證，通過介導多個FAD2基因沉默，使大豆產(chǎn)生高達80%的油酸，在甘藍型油菜中對FAD2基因進行反義抑制，可使油菜油酸含量最高提升至86%，且高油酸表型能穩(wěn)定遺傳［23，24］。

FAD2基因?qū)刂浦参镉退岷蛠営退岷科鸬斤@著作用，其編碼的油酸脫氫酶（FAD2）是脂肪酸代謝路徑的關(guān)鍵酶，能將油酸向亞油酸進行生物轉(zhuǎn)化，但對甘藍型油菜FAD2基因生物信息學系統(tǒng)分析鮮有報道。因此，對甘藍型油菜及其二倍體祖先種FAD2基因進行生物信息學分析具有重要意義。本研究應(yīng)用生物信息學方法，依據(jù)AtFAD2基因信息，在甘藍型油菜及其二倍體祖先種全基因數(shù)據(jù)庫中進行同源比對篩選得到FAD2基因。從氨基酸序列的組成成分、蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)、亞細胞定位、蛋白序列保守結(jié)構(gòu)域、蛋白質(zhì)二級、三級結(jié)構(gòu)以及十字花科蕓薹家族遺傳進化關(guān)系等方面，進行初步預(yù)測分析，最后基于保守結(jié)構(gòu)域序列設(shè)計用于基因編輯靶點序列，并預(yù)期對這些靶點進行基因編輯。期望能夠獲得FAD2基因功能缺失突變體，進而提升子粒油酸含量和菜子油質(zhì)量，為甘藍型油菜FAD2基因的分子機理及分子標記輔助選擇育種提供數(shù)據(jù)支持與參考。

1 材料與方法

1.1 材料

在擬南芥數(shù)據(jù)庫TAIR（https：∕∕www.arabidopsis.org∕）中檢索獲取AtFAD2基因蛋白質(zhì)序列。將其作為參考序列，在蕓薹屬植物基因組數(shù)據(jù)庫BRAD（http：∕∕brassicadb.org∕brad∕）中執(zhí)行Blastp，設(shè)置篩選條件為相似度（Identities）＞60%、E-value值＜1e-80，獲取3個二倍體基本種白菜（B.rapa）、甘藍（B.oleracea）、黑芥（B.nigra）及其2個異源四倍體雜交種甘藍型油菜和芥菜型油菜（B.juncea）的同源蛋白質(zhì)序列。

1.2 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和亞細胞定位分析

利用在線分析工具ExPASyProteomics Server［25］中的ProtParam程序（https：∕∕web.expasy.org∕protparam∕）分析擬南芥、白菜、甘藍以及甘藍型油菜FAD2基因的蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)，包含氨基酸組成、理論等電點（Theoretical pI）、分子質(zhì)量（Molecular mass）、不穩(wěn)定系數(shù)（Instability index）、脂肪酸含量系數(shù)（Aliphatic index）以及疏水性（GRAVY：Grand average of hydropathicity）（當GRAVY值為正值時，說明該蛋白為親水蛋白，為負值時說明為疏水蛋白）；利用在線分析 工 具WoLF PSORT（https：∕∕wolfpsort.hgc.jp∕）和TargetP-2.0（http：∕∕www.cbs.dtu.dk∕services∕TargetP∕）對其進行亞細胞定位預(yù)測分析。

1.3 FAD2基因編碼蛋白質(zhì)序列保守性分析

利用在線分析程序SMART［26］（http：∕∕smart.emblheidelberg.de∕）獲取擬南芥、白菜、甘藍以及甘藍型油菜FAD2蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域序列，運用Clustal W［27］程序進行多序列比對分析。使用在線分析程序MEME Version 5.1.1［28］（http：∕∕meme-suite.org∕tools∕meme），設(shè)置最大基序檢索值為7，分析蛋白質(zhì)的保守基序信息。利用NCBI主頁中Domains&Structures里CD-Search（https：∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕Structure∕cdd∕wrpsb.cgi）在線分析FAD2蛋白質(zhì)序列的保守結(jié)構(gòu)域。

1.4 二、三級蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用SOPMA SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD（https：∕∕npsa-prabi.ibcp.fr∕）網(wǎng) 站在線預(yù)測分析其蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，包括α-螺旋（Alpha helix）、β-轉(zhuǎn)角（Beta turn）、延伸鏈（Extended strand）以及無規(guī)則卷曲（Random coil）等；在線采用SWISS-MODEL分析網(wǎng)站（https：∕∕swissmodel.expasy.org∕interactive）預(yù)測分析蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)并繪圖。

1.5 不同物種間FAD2基因的同源性比較及進化分析

使用軟件MEGA-X［29］中的Clustal W［27］程序?qū)λ@得的3個二倍體基本種及其2個異源四倍體雜交種FAD2基因的蛋白質(zhì)序列進行多重序列比對，生成MEGA格式文件，再使用MEGA-X分析比對結(jié)果，并采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）∕UGPMA構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，設(shè)定泊松校正法計算進化距離和重復1 000次的自展法（bootstrap）檢驗，其余均設(shè)置為默認參數(shù)。

1.6 FAD2基因靶點選擇及sgRNA設(shè)計分析

提交擬南芥FAD2基因（AT3G12120，1）序列到在線sgRNA分析網(wǎng)站（http：∕∕chopchop.cbu.uib.no∕），尋找擬南芥AtFAD2與油菜BnFAD2基因靠近5′端序列作為基因編輯的靶點，在靶點區(qū)域?qū)ふ揖哂蠵AM（NGG）特征序列的位點及其附近序列作為sgRNA序列。從蕓苔屬作物數(shù)據(jù)網(wǎng)站（http：∕∕brassicadb.org∕brad∕index.php）下載甘藍型油菜V4.1、甘藍V1.1與白菜V3.0 CDS序列；使用Blast+2.7.1軟件包Makeblastdb命令分別搭建甘藍型油菜、甘藍與白菜本地化CDS基因組Blastn分析數(shù)據(jù)庫，參數(shù)設(shè)置為-hash_index、-parse_seqids、-dbtypenucl；使用Blastn命令提交sgRNA序列到本地化數(shù)據(jù)庫進行Blast分析，用以判斷該序列是否具有同源拷貝間保守性，不同基因間的特異性，其參數(shù)設(shè)置為-task blastn-short、-qcov_hsp_perc 100、-evalue 6E-06-outfmt 6。

2 結(jié)果與分析

2.1 白菜、甘藍與甘藍型油菜FAD2基因同源蛋白質(zhì)序列的獲取

研究利用AtFAD2基因蛋白質(zhì)序列，通過Blastp分析，分別在白菜、甘藍和甘藍型油菜蛋白質(zhì)基因組數(shù)據(jù)庫中共獲得6條FAD2基因同源蛋白質(zhì)序列，其中白菜、甘藍與甘藍型油菜各有2條（表1）。

表1 FAD2蛋白的理化性質(zhì)和亞細胞定位

2.2 擬南芥、白菜、甘藍與甘藍型油菜FAD2基因基本理化性質(zhì)與亞細胞定位的分析

通過使用Protparam在線程序進行理化性質(zhì)和亞細胞定位分析（表1）。結(jié)果表明，序列最長的為458 aa（BnaC05g40970D），最短的為319 aa（BraA01-g039180.3C）；分子質(zhì)量最大的為52.880 80 kDa（Bna-C05g40970D），最小的為35.737 83 kDa（BraA01g039-180.3C）；理論等電點最高為10.24（BraA01g039-180.3C），最低為8.39（AT3G12120.1），說明所有蛋白質(zhì)中堿性氨基酸所占的比例較大；不穩(wěn)定性系數(shù)值最 高 的 為56.76（BraA01g039180.3C），最 低 的 為35.69（Bol010322），其中有3種為穩(wěn)定蛋白質(zhì)（＜40）；脂肪族指數(shù)最高的為93.48（BraA01g039180.3C），最低的為79.80（Bol007285）；疏水性指數(shù)最高的為-0.094（AT3G12120.1），最低的為-0.263（BnaA05g26-900D），均為疏水性蛋白（負值）。利用在線工具WoLF PSORT預(yù)測分析亞細胞定位，結(jié)果表明所有蛋白質(zhì)均定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。

2.3 蛋白質(zhì)序列的保守性分析

使用在線軟件MEME分析得到的7條FAD2基因的蛋白質(zhì)保守基序，發(fā)現(xiàn)FAD2基因的蛋白質(zhì)具有高度的序列保守性。保守性較高的7基序在7條FAD2蛋白質(zhì)序列中的分布情況見圖1。由圖1可知，各蛋白質(zhì)序列高度保守，但不同植物之間蛋白質(zhì)序列所包含的保守基序種類和數(shù)目有一定的差異，相同物種內(nèi)蛋白質(zhì)保守基序的組成模式更為相似。所有的FAD2蛋白質(zhì)序列都包含Motif1、Motif3和Motif5，說明這些區(qū)域可能是具有重要功能的保守基 序 。AT3G12120.1、BraA05g034790.3C、BnaA05g 26900D和BnaC05g40970D的保守基序組成是完全一致，為Motif6-Motif3-Motif1-Motif5-Motif7-Motif4-Motif2，對比發(fā)現(xiàn)與另外兩組之間保守基序的組成較為相似，Bol010322缺少Motif3，BraA01g039180.3C缺少Motif2和Motif6，而Bol007285僅包含Motif1、Motif5和Motif6 3條基序，較其他基序組成明顯不同，這可能是其在基因家族構(gòu)建的進化樹中單獨分為一支的主要原因。

甘藍型油菜FAD2蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示（圖1），該序列屬于Membrane-FADS-like超家族，含ω-6脂肪酸去飽和酶（PLN02505：omega-6 fatty acid desaturase）的功能性結(jié)構(gòu)域，且能結(jié)合細胞膜上的保守性結(jié)構(gòu)域。

圖1 FAD2蛋白質(zhì)保守基序與結(jié)構(gòu)域預(yù)測

2.4 蛋白質(zhì)的二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)將蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)與一級結(jié)構(gòu)連接，起橋梁和紐帶的作用，也為蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析提供一定的基礎(chǔ)；蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)發(fā)揮作用的主要形式。使用在線工具SOPMA對FAD2蛋白質(zhì)執(zhí)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)FAD2的整體結(jié)構(gòu)由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈以及無規(guī)則卷曲這四部分元件組成（表2），其中α-螺旋、無規(guī)則卷曲這兩部分含量較多，為主要組成元件，β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈含量較少。預(yù)測結(jié)果符合FAD2蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)特征。

表2 FAD2蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 （單位：%）

利用在線工具SWISS-MODEL對BnFAD2蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析（圖2）。由圖2可知，BnFAD2蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、無規(guī)則卷曲構(gòu)成，預(yù)測結(jié)果符合FAD2蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。

圖2 BnFAD2蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.5 蕓薹屬內(nèi)FAD2基因的同源性比較及系統(tǒng)進化分析

通過Blastp方法在蕓薹屬基因組數(shù)據(jù)庫中篩選獲取蕓薹屬物種FAD2基因的同源蛋白質(zhì)序列。使用MEGA-X軟件中的NJ法構(gòu)建擬南芥、甘藍、白菜、蘿卜、黑芥、芥菜型油菜以及甘藍型油菜的FAD2同源蛋白質(zhì)系統(tǒng)進化樹，整體上所有基因主要分為3個不同的類群（圖3）。在第一組中，BniB035019和BjuB006936、BjuA006128和BraA01g039180、BjuB02 3697和BniB010651分別聚集在1個分支上，其同源相似性分別為100%、100%和99%，說明彼此之間的親緣關(guān)系最為接近；在第二組中，BnaC05g40970D、BraA05g034790、BnaA05g26900D和BjuA020389也聚集在一支上，說明其親緣關(guān)系比較接近；而甘藍型油菜BnaA05g26900D和白菜BraA05g034790聚為一支，同源相似性為62%，進一步說明甘藍型油菜的A基因組可能起源于白菜的A基因組。在整個系統(tǒng)進化樹構(gòu)建中，Bol007285單獨被聚為另一支，說明親緣關(guān)系與其他蕓薹屬所有的親緣關(guān)系較遠。

圖3 蕓薹屬FAD2蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進化樹

2.6 FAD2基因sgRNA序列保守性與特異性分析

AtFAD2基因由2個外顯子和1個內(nèi)含子組成，利用在線預(yù)測網(wǎng)站在該基因外顯子序列上共設(shè)計出144條sgRNA，即144個位點可作為CRISPR-Cas9的靶點，均位于第二外顯子上（圖4）。Blastn分析發(fā)現(xiàn)，部分sgRNA序列在白菜、甘藍及甘藍型油菜CDS數(shù)據(jù)庫中完全一致，表明其在同源拷貝間具有高度保守性，這與蛋白質(zhì)序列的保守性分析結(jié)果保持一致。進一步分析，在甘藍型油菜基因庫篩選得到sgRNA序列長度為23 bp，共10條，且僅在FAD2基因中存在，而其他基因中不存在該序列，即CRISPR-Cas9的靶點必須也只能是FAD2基因的各個功能拷貝，不能是其他基因，這表明該序列在不同基因間具有特異性（表3）。

表3 FAD2基因目標靶點的選擇分析

圖4 擬南芥FAD2基因的目標靶點區(qū)域

3 討論

脂肪酸去飽和酶的關(guān)鍵因子FAD2基因?qū)φ{(diào)控植物油酸含量起到重要作用，在不同植物中，深入研究該基因，提升油酸含量從而提高植物油品質(zhì)，成為育種學家一直研究的方向。本研究基于生物信息學，以擬南芥FAD2基因核苷酸和蛋白質(zhì)序列作參考，系統(tǒng)性地預(yù)測分析甘藍型油菜FAD2基因。研究表明，在甘藍型油菜基因組數(shù)據(jù)庫中，共篩選到2條蛋白質(zhì)序列BnaA05g26900D和BnaC05g40970D，其長度均在450 aa左右，分子質(zhì)量在52 kDa左右，理論等電點在9.2左右，不穩(wěn)定系數(shù)在44～46，均定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，推測這很可能是脂肪酸去飽和酶基因的主要特征。FAD2基因在擬南芥和蕓薹屬中的白菜、甘藍和甘藍型油菜具有高度的保守性，均包含Motif1、Motif3和Motif5 3個主要保守基序，這與前人結(jié)果保持一致［18］。進一步預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的蛋白屬于Membrane-FADS-like超蛋白家族，且含脂肪酸去飽和酶的功能和保守結(jié)構(gòu)域，其二級、三級結(jié)構(gòu)基本相吻合，推測FAD2基因與油酸含量高度相關(guān)，與此前研究人員相繼在紅花屬植物和豆科植物得到的結(jié)論相同［30，31］。

隨著研究深入，在設(shè)計FAD2基因靶點以及sgRNA序列保守性與特異性分析發(fā)現(xiàn)，該序列呈高度保守，若對合適位點整合突變，將能提升子粒油酸含量，進而提升菜子油的品質(zhì)。甘藍型油菜屬于異源四倍體，由兩個祖先種白菜和甘藍雜交產(chǎn)生，基因突變來源狹窄，難以獲取相關(guān)優(yōu)良性狀，因此挖掘新的FAD2基因突變材料來拓展種質(zhì)材料的遺傳多樣性是非常必要的。由RNA介導的CRISPR-Cas9系統(tǒng)是一種新型基因編輯的實用工具，在定點誘變中具有顯著優(yōu)勢。Yuan等［32］首次采用CRISPR的基因編輯方法誘導FAD2基因突變，從而開發(fā)具有多種遺傳背景的高油酸系的花生品種；AI Amin等［33］利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)對大豆中FAD2-2基因進行特異性整合突變，獲得大豆油酸高含量。此外利用該系統(tǒng)對FAD2基因進行編輯，已經(jīng)在茶樹［34］、煙草［35］和甘藍［36］等作物上成功應(yīng)用。采用新一代基因編輯CRISPR-Cas9技術(shù)對FAD2基因保守位點進行編輯是可行與必要的。本研究在甘藍型油菜基因庫篩選得到10條sgRNA序列，長度均為23 bp，同源相似度為100%，且該序列只可能在FAD2基因中存在，為CRISPR-Cas9系統(tǒng)在甘藍型油菜FAD2基因中應(yīng)用提供一定數(shù)據(jù)參考。

4 結(jié)論

甘藍型油菜FAD2基因亞細胞均定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，肽鏈表現(xiàn)為疏水性、較穩(wěn)定。蛋白質(zhì)二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，F(xiàn)AD2基因蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為組成成分；蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域顯示，F(xiàn)AD2基因的蛋白質(zhì)具有高度的序列保守性，屬于Membrane-FADS-like超家族，且含PLN02505保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進化樹構(gòu)建分析顯示，甘藍型油菜和白菜、甘藍以及芥菜型油菜具有較近的親緣關(guān)系。CRISPR-Cas9基因編輯靶點分析發(fā)現(xiàn)，甘藍型油菜FAD2基因中存在10個高度序列保守性的靶點位點，并設(shè)計出相應(yīng)的sgRNA。結(jié)果對后續(xù)深入研究FAD2基因的表達調(diào)控及作用機制及利用基因編輯技術(shù)定向突變FAD2基因進而創(chuàng)制高油酸新種質(zhì)資源提供數(shù)據(jù)參考與理論支持。