棉鈴蟲小分子熱激蛋白sHSP22.0基因的克隆及表達譜分析

楊朔 劉少凱 趙少軒 朱宇辰 徐磊 李童云 劉曉光 安世恒 魏紀珍

摘要 ：棉鈴蟲Helicoverpa armigera是一種重要的農業害蟲，本文旨在研究小分子熱激蛋白在其生長發育過程、抵御高溫及Cry1Ac殺蟲蛋白中的功能。利用PCR結合RACE技術克隆了棉鈴蟲sHSP22.0（small heat shock protein 22.0）基因，通過生物信息學軟件分析了棉鈴蟲sHSP22.0基因序列，利用實時熒光定量qRT-PCR分析了該基因在棉鈴蟲不同生長發育階段和組織中的表達模式;并分析了該基因受高溫及Cry1Ac全長蛋白的誘導效應。獲得了棉鈴蟲sHSP22.0（GenBank登錄號： XP_021196802.1） 761 bp cDNA片段，其開放閱讀框576 bp，編碼191個氨基酸，具有小分子熱激蛋白典型的α-晶體結構域（α-crystallin domain，ACD）。sHSP22.0在棉鈴蟲4齡和5齡期特異性表達，尤其在5齡幼蟲的表皮、中腸和后腸內特異性表達。該小分子熱激蛋白受溫度和Cry1Ac全長蛋白的誘導后顯著高表達。sHSP22.0不僅在暴食期及腸道內特異性表達，而且響應Cry1Ac全長蛋白的誘導，表明它在棉鈴蟲消化吸收及抵御外源物的活動中可能起到重要的作用。

關鍵詞 ：棉鈴蟲; 小分子熱激蛋白; sHSP22.0; 溫度; Cry1Ac全長蛋白

中圖分類號：

Q 966

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020009

Molecular cloning and expression profiling of small heat shock protein 22.0 in

Helicoverpa armigera （Lepidoptera： Noctuidae）

YANG Shuo， LIU Shaokai， ZHAO Shaoxuan， ZHU Yuchen， XU Lei， LI Tongyun，

LIU Xiaoguang， AN Shiheng， WEI Jizhen*

（State Key Laboratory of Wheat and Maize Crop Science， College of Plant Protection， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China）

Abstract

Helicoverpa armigera is an important agricultural pest. This study aims to explore the functions of small heat shock protein 22.0 gene （sHSP22.0） in the growth and development of cotton bollworm， and its role in suffering the high temperature and Cry1Ac protein. The full-length cDNA sequence of sHSP22.0 gene was cloned from H.armigera by using PCR and RACE （rapid amplification of cDNA ends） technology， and the sHSP22.0 gene was analyzed by bioinformatics related molecular software. Real-time quantitative PCR （qRT-PCR） was used to assess the expression patterns of sHSP22.0 in different developmental stages and tissues of cotton bollworm. Meanwhile， the expression levels of sHSP22.0 were also checked in the larval after heat and full-length Cry1Ac protein treatments. The results showed that the full-length cDNA sequence of sHSP22.0 （GenBank accession no： XP_021196802.1） was 761 bp with an open reading frame （ORF） 576 bp in length， encoding 191 amino acids， and it had the typical α-crystallin domain （ACD）. The sHSP22.0 gene was specially expressed in 4th and 5th instar larvae， and especially expressed in midgut， hindgut and cuticle of 5th instar larvae. After the heat and full-length Cry1Ac protein treatments， sHSP22.0 showed special expression in 5th instar larvae. The sHSP22.0 gene specially expresses in the gluttony period and gut of H.armigera， and importantly， it is induced by full-length Cry1Ac protein. All the results indicate sHSP22.0 may participate in the activities of the digestion and absorption， and may have the function in defensing against exogenous substrates.

Key words

Helicoverpa armigera; small heat shock protein; sHSP220; temperature; full-length Cry1Ac protein

熱激蛋白（heat shock proteins，HSPs）在生物體內廣泛存在，以應激蛋白和分子伴侶的方式響應外界生物和非生物因子的壓力，參與蛋白質的裝配、折疊和跨膜傳導等眾多的生物過程[12]。按照序列的同源性及分子量的大小，熱激蛋白常被分為4類：HSP90（85～90 kDa）、HSP70（68～73 kDa）、HSP60和小分子量sHSP家族[3]。在自然界中，昆蟲個體較小又是變溫動物，由于長期適應環境的變化，昆蟲體內進化出了種類繁多的熱激蛋白[4]。其中小分子熱激蛋白（sHSP）的數目尤為繁多，它們具有保守的α-晶狀體結構域，但相對于大分子的熱激蛋白，其序列不保守且功能復雜。小分子熱激蛋白的發現也較晚，1974年科學家才從黑腹果蠅Drosophila melanogaster中發現了小分子熱激蛋白[5]，對小分子熱激蛋白的研究較少。后隨著測序技術的發展，更多的小分子熱激蛋白被鑒定出來，例如在家蠶Bombyx mori中發現了16種sHSP，小菜蛾Plutella xylostella中鑒定出15種sHSP，另外棉鈴蟲Helicoverpa armigera中也發現了8種sHSP[68]。研究發現這些小分子熱激蛋白在生物體內表達模式多種多樣，推測它們可能在昆蟲的發育過程和各種生理活動中具有重要的功能，例如調節昆蟲的生長發育和繁殖[912]、抵御溫度變化[1315]、參與昆蟲的滯育[1617]和抵御農藥的危害等[18]。

棉鈴蟲是一種重要的農業害蟲，為害棉花、玉米、花生等幾百種農作物[1920]。近20多年來，人們主要通過種植轉蘇云金芽胞桿菌Bacillus thuringiensis（Bt）殺蟲蛋白基因的作物來防治棉鈴蟲。然而，棉鈴蟲的發生隨著我國農業種植結構的調整產生了明顯的變化，玉米、花生、蔬菜等非Bt作物種植面積增加，棉鈴蟲寄主植物發生了轉變，從而致使其種群密度不斷增加，為害加重[21]。因此對棉鈴蟲的研究和防治仍然任重而道遠。

在棉鈴蟲中，不同分子量的熱激蛋白逐漸被鑒定出來，但是具體每種熱激蛋白的功能研究還處于初級階段。棉鈴蟲熱激蛋白HSP70和HSP21.4基因在棉鈴蟲滯育蛹的腦中高表達[2223]，隨后研究發現熱效應因子HSF1（heat shock factor 1）在棉鈴蟲滯育階段調控Hsp70的上調表達，參與了棉鈴蟲滯育[24]。棉鈴蟲熱激蛋白Hsp19.5、Hsp19.7、Hsp22.0、Hsp272、Hsp60、HSC70、Hsp200、Hsp20.7、Hsp20.8、Hsp21.4、HSC90基因響應光脅迫，這些熱激蛋白以不同的方式協調保護昆蟲免受紫外線的傷害[8]。經37℃到42℃熱激處理后，棉鈴蟲幼蟲唾液腺中，Hsp70和Hsp64高豐度表達，但在幼蟲的馬氏管、睪丸和脂肪體中Hsp70幾乎不表達而Hsp64高水平表達[25]，這預示著不同的熱激蛋白在不同的組織中可能發揮不同的功能。棉鈴蟲Hsp70和Hsp90在溫度高于38℃時表達量會隨溫度的升高逐漸升高，這可能與環境溫度適應相關[26]。蛋白質組學研究表明，棉鈴蟲HSP70可與Cry1Ac蛋白結合[27]，Cry1Ac殺蟲蛋白處理后，棉鈴蟲幼蟲HSP70基因的表達量降低[28]。

上述對棉鈴蟲熱激蛋白的鑒定和功能研究在一定程度上豐富了熱激蛋白的研究。但是隨著氣溫的變化及轉cry1Ac基因的棉花在我國的全面推廣等，來自外界的環境壓力迫使棉鈴蟲快速適應環境變化，而熱激蛋白在棉鈴蟲抵御環境壓力中的功能還急需研究，這對棉鈴蟲的種群控制具有重要的意義。在本研究中，我們通過分子生物學手段，克隆了棉鈴蟲的一個小分子熱激蛋白sHSP22.0基因，分析了它在棉鈴蟲不同發育歷期和組織中的表達譜，并比較了其在受到高溫和Cry1Ac全長蛋白誘導時的表達情況，為豐富棉鈴蟲熱激蛋白的研究及棉鈴蟲的防控提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試棉鈴蟲及Bt殺蟲蛋白

本研究中供試棉鈴蟲為未接觸任何生物殺蟲劑或化學殺蟲劑的棉鈴蟲敏感種群LF品系（中國農業科學院植物保護研究所棉花害蟲組梁革梅研究員贈予），幼蟲取食棉鈴蟲人工飼料，成蟲取食10%的糖水，于室內相對濕度（75±10）%，溫度（27±2）℃和光周期L∥D=14 h∥10 h條件下連續飼養15年[29]。

Cry1Ac全長蛋白購于北京綻諾思特生物科技有限公司。

1.2 樣品準備

1.2.1 棉鈴蟲各發育階段和組織樣品的準備

飼養棉鈴蟲，分別收集1齡（20頭）、2齡（10頭）、3齡（5頭）、4齡（3頭）、5齡（3頭）、蛹（3頭）和成蟲（3頭），為1個生物學重復，用于研究sHSP22.0基因在棉鈴蟲各發育階段的表達模式。取5齡第2天棉鈴蟲10頭，在冰上解剖棉鈴蟲的前腸、中腸、后腸、馬氏管和表皮。解剖后，前腸、中腸和后腸用4℃預冷的0.7% NaCl溶液洗去內含物，用濾紙吸干水分后保存備用，用于比較不同組織中sHSP22.0基因的表達差異。上述樣品一經處理后，立即放入液氮冷凍，再轉放到-80℃冰箱中保存備用，3次生物學重復。

1.2.2 高溫處理樣品的準備

取27℃正常飼養的5齡棉鈴蟲，放入40℃培養箱，處理1 h和2 h后，立即放入液氮中冷凍，再轉存到-80℃冰箱中保存備用。同樣取生長狀況一致的棉鈴蟲，于27℃分別處理1 h和2 h為對照。每個處理包括4次生物學重復，每個重復取樣3頭。

1.2.3 Cry1Ac處理樣品的準備

飼養棉鈴蟲，取5齡第1天棉鈴蟲，饑餓24 h后，轉到含30 μg/mL Cry1Ac全長蛋白（經預試驗，該濃度是處理5齡棉鈴蟲幼蟲7 d后LC30的劑量）或不含Cry1Ac全長蛋白的人工飼料上，飼喂1 h和2 h后，立即轉移到冰上解剖取中腸，步驟同1.2.1。每個處理包括4次生物學重復，每個重復取樣10頭。

1.3 總RNA的提取和cDNA合成

以上各備用樣品總RNA的提取采用TRIzol法，按Invitrogen的操作說明提取。RACE擴增所用的cDNA模板的合成參考SMART-RACE cDNA Amplification Kit 說明書操作，樣品為棉鈴蟲5齡幼蟲的中腸組織。熒光定量qRT-PCR所用cDNA模板依照SuperReal PreMix（Probe）說明書合成。

1.4 棉鈴蟲sHSP22.0全長基因克隆

根據前期實驗室得到的棉鈴蟲的轉錄組數據[30]，獲得sHSP22.0的部分序列，利用軟件Primer 5.0設計特異性5′RACE引物sHSP22.0-RACE-5′（表1），以敏感棉鈴蟲cDNA為模板，擴增其5′端序列。PCR的反應體系為25 μL：1 μL cDNA，2.5 μL 10×Buffer， 0.25 μL LATaq，0.5 μL sHSP22.0-RACE-5′引物（10 mmol/L），2.5 μL UPM，18.25 μL無菌水。PCR反應程序：94℃預變性4 min;94℃變性30 s，72℃ 延伸3 min， 循環5次;94℃變性30 s，70℃ 退火30 s， 72℃延伸3 min，循環5次;94℃變性30 s，68℃ 退火30 s， 72℃延伸3 min，循環35次;72℃延伸10 min。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切割目的條帶，送北京博邁德基因技術有限公司進行序列測定。測序成功后拼接序列，設計特異性引物sHSP22.0-ORF-F和sHSP22.0-ORF-R（表1），以棉鈴蟲中腸cDNA為模板，擴增其開放閱讀框，PCR的反應體系為25 μL： 1 μL cDNA， 0.5 μL sHSP22.0-ORF-F引物（10 mmo/L）和0.5 μL sHSP22.0-ORF-R引物（10 mmo/L），1 μL dNTPs，2.5 μL 10×EasyTaq Buffer，0.25 μL EasyTaq E，19.25 μL無菌水。PCR反應程序：94℃預變性4 min;94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環35次;72℃延伸10 min。反應結束后，如上述方法檢測并測序。

1.5 序列分析和系統發育樹的構建

利用基因探索者軟件分析sHSP22.0基因，預測其開放閱讀框長度，并對閱讀框進行翻譯;利用在線軟件（https：∥web.expasy.org/compute pi/）和SWISS-MODEL分析該小分子熱激蛋白的相對分子量、等電點和結構域;再在NCBI數據庫中進行BLASTp 同源序列分析，選取同源性較高的不同昆蟲的小分子熱激蛋白，利用MEGA 7（7014）軟件，選用Jones-Taylor-Thornton（JTT）模型，利用最大相似法（maximum likelihood method）構建系統進化樹進行聚類分析。

1.6 熒光定量RT-PCR分析

根據上述擴增得到的棉鈴蟲sHSP22.0的cDNA序列，送Invitrogen公司設計并合成Taqman探針sHSP22.0-RTPCR-P（5′端用FAM標記，3′端用MGB標記）及熒光定量RT-PCR的特異性引物sHSP22.0-RTPCR-F和sHSP22.0-RTPCR-R（表1）。熒光定量采用雙內參法，內參基因分別為棉鈴蟲Actin基因（GenBank 登錄號：X97615.1） 和glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH基因）（GenBank 登錄號 JF417983.1）。20 μL RT-PCR反應體系包括正向和反向引物（10 μmol/L）各0.6 μL，探針（10 μmol/L）0.4 μL，MaximaR Probe/ROX qPCR Master Mix（2×）10 μL，cDNA2 μL和無菌水6.4 μL。于7500 Fast實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）中進行擴增。反應程序為：95℃預變性10 min;95℃變性3 s，60℃退火/延伸30 s，循環40次。qRT-PCR進行3次技術重復。數據分析使用相對定量分析方法，計算公式采用2-ΔΔCt法[31]。

1.7 數據處理

利用DPS7.05軟件對試驗數據進行方差分析，其中不同發育階段，不同組織，溫度或Cry1Ac全長蛋白不同處理時間之間的方差分析采用單因素Tukey法，在P<0.05水平進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 棉鈴蟲sHSP22.0基因序列及系統進化位置

從棉鈴蟲中腸組織cDNA中擴增得到一條761 bp的基因序列，開放閱讀框為576 bp，編碼191個氨基酸，GenBank登錄號為XP_021196802.1。在線軟件預測其蛋白分子量為22.0 kDa，等電點為6.54。同時對該基因結構域的預測分析表明它具有可變的N-末端區域（氨基酸殘基1—49），小分子熱激蛋白保守的α-晶狀體結構域（氨基酸殘基 50—159），以及C-末端區域（氨基酸殘基160—191）（圖1），屬于典型的小分子熱激蛋白，我們將其命名為sHSP22.0。

在NCBI數據庫中進行BLASTp 同源序列分析，棉鈴蟲sHSP22.0的氨基酸序列與其他18種昆蟲的序列同源性較高，與小分子熱激蛋白具有類似的α-晶狀體結構域（圖2）。但是，棉鈴蟲sHSP22.0與不同昆蟲的sHSPs比較，N端差異顯著（圖2）;同時，sHSP22.0與不同分子量的熱激蛋白間C-端也存在較大差異（圖2）。通過比對分析，棉鈴蟲sHSP22.0的氨基酸序列與斜紋夜蛾Spodoptera litura l（2）efl（protein lethal（2）essential for life-like，l（2）efl，同屬小分子的熱激蛋白家族基因）氨基酸序列同源性在90%以上;與其他被比較的鱗翅目夜蛾科昆蟲的氨基酸同源性在70%以上（圖2）。

利用MEGA 7（7. 0.14）軟件，采用最大似然法進一步分析了棉鈴蟲sHSP 22.0基因的進化關系，我們以白符跳Folsomia candida為外群，將棉鈴蟲sHSP22.0氨基酸序列與18種昆蟲的相近基因的氨基酸序列進行了進化樹分析（圖3）。結果表明，棉鈴蟲sHSP22.0與鱗翅目昆蟲的sHSP聚在了同一進化支上，其中與已經鑒定的斜紋夜蛾S.litura l（2）efl的進化關系最近，其次是煙草天蛾M.sexta l（2）efl（圖3）。這與上述氨基酸序列同源性分析結果一致。

2.2 sHSP22.0在棉鈴蟲不同發育期和組織中的表達

通過qRT-PCR分析，sHSP22.0的表達主要在幼蟲4齡和5齡階段，在幼蟲的低齡期、蛹和成蟲中均未檢測到sHSP22.0的表達（圖4a）。進一步分析sHSP22.0基因在棉鈴蟲5齡幼蟲各組織中表達的情況，發現該基因在中腸、后腸和表皮中均有表達，后腸中表達量最高，其次是表皮和中腸中，但是在前腸和馬氏管中沒有檢測到其表達（圖4b）。

2.3 sHSP22.0在棉鈴蟲受高溫和Cry1Ac全長蛋白誘導時的表達差異

40℃處理后，sHSP22.0基因的表達顯著上調，特別是在處理1 h時，表達量顯著上調6 240.28倍（F=365.16， P=0.000 1）（圖5a）。除此之外，sHSP22.0基因的表達還受到Cry1Ac全長蛋白的誘導，棉鈴蟲在取食Cry1Ac全長蛋白后1 h和2 h，該基因均顯著上調表達（F=22.185，P=0.000 3），最高在1 h時表達量上調20.53倍（圖5b）。

3 討論

通過分析棉鈴蟲熱激蛋白sHSP22.0的基因序列，發現其是典型的小分子熱激蛋白家族的基因，也具有α-晶狀體結構域。小分子熱激蛋白的N端多變[3]，同源序列分析表明不同熱激蛋白分子間的N端差異也較大。本研究中棉鈴蟲sHSP22.0與其他被比較的小分子量熱激蛋白間C-端也存在較大差異，這可能是由于被鑒定的小分子熱激蛋白數量有限，sHSP22.0與被比較的其他鱗翅目昆蟲的sHSP之間在分子量上存在差異，也可能是由于小分子熱激蛋白的多樣性造成的[4]。盡管被比較的小分子熱激蛋白存在一定的差異，但是棉鈴蟲sHSP22.0與其他鱗翅目昆蟲的小分子熱激蛋白仍具有較高的同源性，并聚為一支。

在棉鈴蟲1齡、2齡和3齡幼蟲，蛹和成蟲，以及在5齡期的馬氏管和前腸均沒有檢測到sHSP22.0基因的表達。這種小分子熱激蛋白基因在某些發育階段或組織中不表達的現象在小菜蛾中也有報道，其中sHSP18.8在小菜蛾幼蟲3齡和4齡階段不表達，sHSP19.23和sHSP23.4在卵中不表達[32]。熱激蛋白在一些發育階段不表達可能預示著它們沒有參與這個階段的生理生化活動。sHSP22.0基因在棉鈴蟲幼蟲4齡和5齡期特異性表達，這種小分子熱激蛋白在特定的幼蟲期表達的現象在其他昆蟲中也普遍存在。例如，地中海實蠅Ceratitis capitata的2個hsp23基因在幼蟲階段高表達[33]。組織特異性分析發現sHSP22.0基因在5齡棉鈴蟲中腸和后腸中特異性表達，這種組織特異性表達同樣也有報道，例如家蠶的sHSP20.4在中腸內特異性高表達[17]，小菜蛾的4個小分子熱激蛋白基因sHSP19.5、sHSP20.1、sHSP21.6和sHSP21.8在腸道內的表達高于其他組織[32]。基因的階段性或組織特異性表達往往預示著它可能參與到了該階段或組織中的生命活動。棉鈴蟲作為重要的農業害蟲，主要危害階段是幼蟲期，尤其4齡和5齡是棉鈴蟲的暴食階段，也是棉鈴蟲重要營養階段。棉鈴蟲sHSP22.0基因在這個階段的特異性表達，尤其在腸道內的相對高表達，表明sHSP22.0基因在棉鈴蟲消化吸收以及抵御外源物等活動中可能起到重要的作用。sHSP22.0基因除了在腸道內特異性表達外，還在棉鈴蟲表皮中表達。小分子熱激蛋白在表皮中特異性表達的現象在小菜蛾中也有報道，Chen 等[32]在小菜蛾中鑒定到了5種小分子熱激蛋白在表皮中超表達。表皮是昆蟲抵御外界侵入的重要保護屏障，sHSP22.0基因在表皮中的特異性表達，再次表明它可能參與昆蟲抵御外源物過程。根據熱激蛋白的功能研究，推測它可能通過維持昆蟲正常的器官功能或作為蛋白質的重要分子伴侶保護蛋白質的正常功能的方式抵御外界侵害[35]。

熱激蛋白分子受高溫誘導表達的反應是昆蟲適應溫度變化的重要保護機制。熱激蛋白的表達受溫度的誘導，但是表達一般具有瞬時性，短則幾分鐘就可以檢測到昆蟲體內熱激蛋白表達量增加，長則在1～2 h時積累量會達到高峰，隨后會顯著下降[36]。棉鈴蟲熱激蛋白sHSP22.0具有熱激蛋白分子典型的小分子結構[3738]，而且我們發現其表達水平在受溫度誘導1 h后顯著上調6 240.28倍。高溫可以誘導小分子熱激蛋白的表達，這種現象在其他昆蟲中也較為常見，例如高溫可以顯著誘導小菜蛾12種小分子熱激蛋白基因表達[32]，腰腹長體繭蜂Macrocentrus cingulum的Hsp23.8和柞蠶Antheraea pernyi的Hsp21經熱激后也可迅速上調表達[3940]。自然界中，溫度在調控生物的生理生化過程中起著重要的作用，尤其對于昆蟲這種變溫動物。棉鈴蟲熱激蛋白sHSP22.0快速顯著地響應溫度的誘導，表明它在幫助棉鈴蟲適應不利條件，保護自身正常生理活動中起到非常重要的作用。

本研究中棉鈴蟲sHSP22.0也響應Cry1Ac全長蛋白的誘導，1 h時表達可上調20.53倍。據報道云杉夜蛾Choristoneura fumiferana取食亞致死劑量的Cry1Ab全長蛋白后，HSP90的表達量顯著上調[41]。這表明棉鈴蟲sHSP22.0在抵御Cry1Ac全長蛋白的作用過程中可能起到重要的作用。然而，另有研究報道棉鈴蟲取食Cry1Ac全長蛋白后，HSP70的表達量降低[28]。這顯示小分子熱激蛋白與大分子熱激蛋白的功能可能存在差異，對于棉鈴蟲sHSP220具體在棉鈴蟲抵御高溫和Cry1Ac全長蛋白中如何發揮功能還需要進一步的深入研究。

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（責任編輯：楊明麗）