番茄褪綠病毒病預測預報模型的建立

盧丁伊慧 張戰泓 張卓 張德詠 譚新球 鄭立敏 高陽 史曉斌 劉勇

摘要 ：研究煙粉虱傳播番茄褪綠病毒Tomato chlorosis virus （ToCV）的發生規律，建立其預測預報模型，能夠指導田間早期有效防治。本研究于2014年-2018年每年采集山東壽光蔬菜基地大棚番茄和雜草的植株葉片，并收集植株上攜帶的所有煙粉虱，以健康番茄、雜草葉片和室內飼養的健康煙粉虱為陰性對照;實驗室ToCV侵染性克隆接種的感病葉片以及從感病葉片上獲毒的煙粉虱為陽性對照，將采集的樣品帶回實驗室進行檢測和鑒定等試驗。根據病情發生規律，建立了番茄褪綠病毒病的預測預報模型，模擬所得方程為：Y=2.570+0.089X4-7.548X7，其中Y為11月份番茄褪綠病毒病發生率，X4為采集的樣品上平均每株所攜帶的煙粉虱數量，X7為采集的田間雜草的帶毒率。預測模擬結果顯示，煙粉虱數量以及雜草的帶毒率與番茄褪綠病毒病的發生率極顯著正相關，回歸檢測結果歷史符合率為96.8%以上。明確了影響番茄褪綠病毒病發生的影響因子，基于煙粉虱數量以及雜草的帶毒率，構建了病害預測預報模型。研究結果有助于及時發現番茄褪綠病毒病并采取相應預防措施。

關鍵詞 ：番茄褪綠病毒; 煙粉虱; 發展規律; 預測預報模型

中圖分類號：

S 436.412.11

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020029

Establishment of the prediction model for tomato chlorosis virus disease

LU Dingyihui1，2， ZHANG Zhanhong3， ZHANG Zhuo2， ZHANG Deyong2， TAN Xinqiu2， ZHENG Limin2， GAO Yang2， SHI Xiaobin1，2*， LIU Yong2*

（1. Longping Branch， Graduate School of Hunan University， Changsha 410125， China; 2. Institute of Plant Protection， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， China; 3. Vegetable Research Institute， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， China）

Abstract

The occurrence and development of Tomato chlorosis virus （ToCV） transmitted by Bemisia tabaci were investigated by establishing disease prediction models to provide a reference for effective control of ToCV causing disease in the field. The plant leaves of greenhouse tomatoes and weeds were collected in the Shouguang Vegetable Base in Shandong province every year from 2014 to 2018， and all B.tabaci individuals feeding on the plants were collected. Healthy tomatoes， weed leaves and healthy B.tabaci raised indoors were used as negative controls. Leaves inoculated with ToCV in the laboratory and viruliferous B.tabaci on infected leaves were used as positive controls. The collected samples were taken back to the laboratory for ToCV testing and identification. According to the development of ToCV disease， we established the disease prediction model： Y=2.570+0.089X4-7.548X7， in which Y is the incidence of tomato chlorosis virus disease in November; X4is the average number of B.tabaci carried by each sample， and X7is the viruliferous rate of weeds collected in the field. The results revealed that the incidence of the disease showed significantly positive correlation with the population of B.tabaci and the infection rate of weeds. The compliance rate of this prediction model was above 96.8%， suggesting that it can provide an important basis for predicting diseases in time and take preventive measures.

Key words

Tomato chlorosis virus; Bemisia tabaci; occurrence and development trend; prediction model

番茄褪綠病毒Tomato chlorosis virus （ToCV）屬于長線性病毒科Closteroviridae，毛形病毒屬Crinivirus，是我國新報道的對番茄、辣椒等茄科蔬菜造成毀滅性危害的RNA病毒[1]。植株感染ToCV后下部老葉首先出現癥狀，葉脈保持綠色，但葉片脈間褪綠黃化，葉片變厚卷曲容易折斷;隨后植株病變部位由下向上蔓延，葉片由葉緣向內逐漸干枯壞死;最終整個植株變黃，迅速衰老，果實生長發育也受到限制，從而使果實的銷售價值受到嚴重影響[2]。為了預防番茄褪綠病毒的傳播，減少病毒病造成的損失，找到影響發病的關鍵因素，構建其預測預報模型迫在眉睫。

番茄褪綠病毒不能通過汁液摩擦傳播[3]，只能依靠介體昆蟲傳播，主要媒介昆蟲是煙粉虱Bemisia tabaci、溫室白粉虱Trialeurodes vaporariorum和紋翅粉虱T.abutilonea[4]，我國ToCV的介體昆蟲主要是煙粉虱。番茄褪綠病毒病最早在我國臺灣報道后，相繼在山東、山西、江蘇和北京等多地發現[4]。Wintermantel等報道了番茄褪綠病毒的發生特點及其危害[1];鄭慧新等調查發現番茄褪綠病毒病已在我國很多地區快速擴散[4];代惠潔等研究了山東壽光地區Q型煙粉虱傳播番茄褪綠病毒的特點，發現二者的發生存在緊密聯系[5];Shi等比較了Q型與B型煙粉虱獲取、保留和傳播ToCV的能力，發現在我國ToCV的發生與Q型煙粉虱較強的傳毒能力密切相關[6];魏可可等報道了番茄褪綠病毒常用的鑒別方法[7]。目前研究多集中在發生規律以及流行原因的調查，缺乏田間預測該病毒病發生的預測預報模型。

2014年我們在山東壽光調查發現，蔬菜基地的許多大棚番茄以及田間雜草表現出葉脈間褪綠、葉片黃化等癥狀，同時眾多葉片背面聚集了大量煙粉虱，因而開展了煙粉虱傳播番茄褪綠病毒病的發生規律的研究。通過總結2014年-2018年山東壽光地區番茄褪綠病毒病的發生情況，并結合當地氣象資料、煙粉虱的種類和帶毒情況以及雜草種類和帶毒情況，對煙粉虱傳播番茄褪綠病毒病的發生發展規律進行了分析并建立了預測預報模型。根據建立的預測模型，可以明確影響番茄褪綠病毒病發生的

主要因素，從而采取有效措施及時進行預防和控制，有效降低番茄褪綠病毒病的發生。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2014年-2018年，每年的11月份在壽光的大棚中調查番茄褪綠病毒病的發生率，并且用小型氣象記錄儀自動記錄11月份每天的光照時間、溫度和濕度。在調查的大棚中隨機選取20行，每行采集1株番茄，共采集20株，采集時先用吸蟲管吸取番茄上所有的煙粉虱，將每株番茄上收集的煙粉虱裝到一個離心管中，同時統計所有雜草種類數，并從每行番茄附近的雜草中隨機選擇1株，共20株，采集其地上部分葉片，將采集的樣品置于液氮中速凍后單株保存于-80℃冰箱保存備用，用于后續提取其基因組（DNA或RNA）等試驗，以健康番茄和田邊地間雜草葉片為陰性對照;實驗室ToCV侵染性克隆接種的感病葉片為陽性對照[8]。

1.2 植物總RNA的提取

采用北京華越洋生物公司多酚多糖植物RNA提取試劑盒提取大棚番茄和雜草樣品的總RNA[910]，具體步驟按照RNA提取試劑盒說明書。

1.3 煙粉虱總RNA的提取

采用TRIzol法來提取煙粉虱樣品總RNA[1113]。

1.4 cDNA的合成

以提取的總RNA為模板進行反轉錄。反轉錄反應的體系及步驟參照Vazyme生物公司Hiscript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit產品說明書。

1.5 RT-PCR和電泳檢測

采用ToCV特異性引物ToCV-3F/ToCV-3R（表1）對樣品進行PCR擴增[1415]。PCR擴增體系為： RNase-free ddH2O 7 μL、2×Taq Master Mix 10 μL、10 μmol/L ToCV-3F/ToCV-3R 各1 μL、cDNA模板1 μL。PCR程序為：95℃ 5 min;95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環;72℃延伸10 min，4℃保存。電泳檢測后，產物純化回收送生工生物工程（上海）股份有限公司測序分析。

1.6 煙粉虱數量及帶毒率檢測

以株為單位統計1.1采集的20株番茄植株上所有煙粉虱數量，并計算平均每株番茄上煙粉虱數量。從每株番茄植株上采集到的煙粉虱中隨機選取20頭，番茄植株上不足20頭的按照實際數量進行統計和計算。采用ToCV特異性引物ToCV-3F/ToCV-3R對每頭煙粉虱進行ToCV檢測，其中每株上采集20頭煙粉虱的帶毒率作為1個重復，共進行20次重復，統計20株番茄上所攜帶的煙粉虱的帶毒率，取平均值得到最終煙粉虱帶毒率。

每株番茄上的煙粉虱帶毒率=攜帶ToCV的煙粉虱數/檢測煙粉虱數×100%。

1.7 煙粉虱種群的鑒定

從每株番茄植株上采集的煙粉虱樣品中隨機取1頭，20株番茄植株共取20頭對其mt COⅠ基因進行檢測，重復3次[18]。取3 μL蛋白酶K于封口膜上，每頭煙粉虱置于膜上研磨成勻漿后移至PCR管，加入10 mg/mL的樹脂溶液20 μL混勻，然后置于37℃孵育1 h，96℃ 10 min。PCR體系為20 μL，即RNase-free ddH2O 7 μL、2×Taq Master Mix 10 μL、10 μmol/L上、下游引物WT-F/WT-R（表1）各1 μL，cDNA模板1 μL。PCR程序：95℃ 5 min;95℃ 15 s，53℃ 45 s，72℃ 1 min，35個循環;72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產物取5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

隨后取PCR產物進行酶切。酶切體系：10 μL擴增產物，0.5 μL AseⅠ、2 μL 3.1×Buffer、7.5 μL RNase-free ddH2O，混勻后置于37℃ 3～4 h。取5 μL酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。mt COⅠ PCR產物經酶切后， Q型煙粉虱電泳顯示約500 bp和100 bp兩條帶， 而B型煙粉虱在500～750 bp間僅有1條帶[17]。

1.8 田間雜草種類及其帶毒率

首先統計番茄附近所有雜草的種類，然后利用ToCV特異性引物ToCV-3F/ToCV-3R對隨機選取的20株雜草進行鑒定。每株雜草取上、中、下部位的3片葉分別進行檢測，共檢測大約60片葉，若上、中、下部位中有1處被檢測出帶毒，即為該雜草帶毒，最后統計雜草的帶毒率。計算公式：雜草帶毒率=攜帶ToCV的雜草數/檢測雜草數×100%。

1.9 回歸方程的建立

相關性分析：利用2014年-2018年山東壽光11月份番茄褪綠病毒病發生率與各自變量因子在SPSS 21.0中進行相關顯著性分析[19]。

逐步回歸分析：利用相關性分析結果在SPSS 21.0中進行回歸分析[1921]。

1.10 方程的擬合性分析

利用SPSS 21.0分析軟件輸出的回歸方程對2014年-2018年與番茄褪綠病毒病發病率相關的因素：11月份平均每日光照時間，11月份平均溫度，11月份平均相對濕度，每株采集的樣品上所攜帶的平均煙粉虱數量，采集的樣品上所攜帶的煙粉虱的帶毒率，采集的田間雜草的種類，采集的田間雜草的帶毒率進行擬合性檢驗，并對歷史符合率進行分析[2223]。

2 結果與分析

2.1 大棚番茄ToCV的發病率

通過觀察發現，大多數大棚番茄在苗期、花期、結果期均可被ToCV感染（圖1）。不同年份番茄均存在較高的發病率（表2）。對田間采摘的大棚番茄樣品進行RT-PCR檢測，驗證了ToCV的侵染。

2.2 煙粉虱數量及帶毒率檢測

統計發現，2014年-2018年大棚番茄所攜帶的煙粉虱平均每株數量在18～59頭（表3）。每年從采集的樣品中隨機選取20頭進行RT-PCR檢測，發現煙粉虱均存在較高的帶毒率（65%～95%）（表3）。可以看出，隨著煙粉虱數量的增加，煙粉虱帶毒率也隨之升高。

2.3 煙粉虱種類鑒定

對大棚番茄上采集的煙粉虱進行種類鑒定，提取單頭煙粉虱總DNA進行PCR擴增，PCR產物經AseⅠ酶切后，進行電泳檢測，得到500 bp和100 bp的兩條帶，結果表明該地區的煙粉虱均為Q型煙粉虱（圖2）。

2.4 田間雜草種類及其帶毒率

2014年-2018年每年采集的雜草種類及其帶毒率各有不同。可以看出，隨著雜草種類的增加，雜草帶毒率呈上升趨勢（表4）。

2.5 番茄褪綠病毒病預測預報模型的建立

通過總結番茄褪綠病毒病發病率相關資料發現，2014年-2018年，與番茄褪綠病毒病發病率相關的因素可能有：11月份平均每日光照時間、11月份平均溫度、11月份平均相對濕度、每株番茄平均煙粉虱數量及其帶毒率、田間雜草種類以及帶毒率（表5）。

利用2014年-2018年山東壽光11月份番茄褪綠病毒病發生率與各自變量因子在SPSS 21.0中進行相關顯著性分析，獲得了2個與11月份番茄褪綠病毒病發生率在0.01水平上極顯著因子，X4：平均每株煙粉虱數量（頭）;X7：田間雜草的帶毒率（%）。獲取了2個與11月份番茄褪綠病毒病發生率在0.05水平上顯著因子，X5：煙粉虱的帶毒率;X6：田間雜草的種類數。

利用相關性分析結果進行回歸分析，將Y（ToCV發生率）添加到因變量列表，將X4（平均每株煙粉虱數量）、X5（煙粉虱帶毒率）、X6（雜草種類數）和X7（雜草帶毒率）添加到自變量列表，輸出模型匯總表、方差分析表和回歸系數表。

由回歸系數表可得到回歸方程：Y=2.570+0.089X4-7.548X7（R2=0.998）。

2.6 番茄褪綠病毒病預測預報模型的準確度

對相關數據進行擬合性檢驗，發現回歸檢測結果歷史符合率均在96.8%以上，因而可以作為番茄褪綠病毒病發生程度的預測預報模型（表6）。

1） Y： 11月份番茄褪綠病毒病發生率; X1： 11月份平均每日光照時間; X2： 11月份平均溫度; X3： 11月份平均相對濕度; X4： 平均每株番茄上攜帶的煙粉虱數量; X5： 采集樣品上煙粉虱的帶毒率; X6： 采集的田間雜草的種類數; X7： 采集的田間雜草的帶毒率。

Y： The incidence of tomato chlorosis virus disease in November; X1： The average daily light time in November; X2： Mean temperature in November; X3： The average relative humidity in November; X4： The average number of Bemisia tabaci carried by each sample; X5： The virus-carrying rate of B.tabaci on the collected samples; X6： The species of weeds collected in the field; X7： The viruliferous rates of weeds collected in the field.

3 討論

3.1 田間發病規律

關于番茄褪綠病毒病的田間發病規律已有較多的研究[2428]。李嬌嬌等發現Q型煙粉虱及ToCV的多發季節在秋季，并指出11月上旬之后，日光溫室平均溫度一般低于20℃，已不利于煙粉虱的繁育與傳播，因而病害發生相對較輕[26]。本研究調查發現試驗基地的大棚番茄于7月底或者8月初種植，這段時間溫度高，空氣相對濕度低，有利于番茄幼苗的生長，但同時容易滋生煙粉虱。而在溫室中極易存在攜帶ToCV的煙粉虱，溫室外存在攜帶ToCV的雜草，進而造成了番茄褪綠病毒的傳播。ToCV的侵染存在潛伏期，病毒侵染初期植株并沒有表現癥狀，而到11月份，大棚番茄進入發病的高峰期。

3.2 番茄褪綠病毒病發生率與煙粉虱數量的關系

運用SPSS 21.0對各因素進行相關性分析發現，ToCV的發生率與煙粉虱數量呈極顯著正相關。此外，調查發現，大棚中的煙粉虱均為Q型，且每株番茄上的煙粉虱均攜帶病毒。預測預報模型也表明番茄褪綠病毒病的發生率與采集的每株植株上所攜帶的平均煙粉虱數量在0.01的水平上極顯著相關。此結論與李嬌嬌等[28]的結論有出入，而與代惠潔等[25]報道的結論相似，這可能與地域等自然環境引起的差異有關。因此應在種植早期重視對煙粉虱的防治，從而減輕ToCV的發生。

3.3 番茄褪綠病毒病發生率與雜草帶毒率的關系

相關性分析發現，ToCV的發生率除了與煙粉虱數量極顯著正相關外，還與田間雜草的帶毒率在0.01的水平上極顯著正相關。代惠潔等指出番茄定植前需徹底清除棚內及周邊雜草，切斷可能的毒源有利于番茄褪綠病毒的防控[27]。這與本研究所得結論一致，同時也驗證了預測預報模型的準確性。結合預測結果可以發現，田間雜草能夠攜帶并保存ToCV，在溫室大棚中，在上一季番茄收獲之后，病毒都在雜草中保存，隨著煙粉虱的發生，再次侵染新一季的番茄，從而造成病害的循環發生。我們還發現雜草種類越多，ToCV的發生率越高，因此今后有必要調查清楚ToCV的雜草寄主，從而更有針對性地清除雜草，以降低ToCV的發生。

3.4 構建模型的意義

利用SPSS 21.0建立預測預報模型，模擬所得方程為：Y=2.570+0.089X4-7.548X7，其中Y為11月份番茄褪綠病毒病發生率，X4為采集的

番茄上平均每株攜帶的煙粉虱數量，X7為采集的田間雜草的帶毒率，回歸檢測結果歷史符合率為96.8%以上。通過構建煙粉虱傳播番茄褪綠病毒病的預測預報模型，明確了番茄褪綠病毒發生過程中的重要影響因子，為預防番茄褪綠病毒病的發生提供了重要依據，有助于及時發現番茄褪綠病毒病并采取相應的預防措施，從而減少其造成的經濟損失，實現番茄的高產提質優化。

煙粉虱傳播的番茄褪綠病毒病的預測預報模型是在特定的時間、空間條件下采用一定的資料構建出來的模型，可能不具有普遍適用性。不同地區，不同氣象因素和不同的生長條件也可能會影響ToCV的發生，還需要進行不斷地探索。

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（責任編輯：楊明麗）