miR-503、PKD1在非小細胞肺癌患者外周血中的表達及臨床意義

吳艷麗 熊艷 蘆爽 孫厚斌

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中最常見的組織學類型，腺癌和鱗癌是NSCLC最常見的兩種病理類型，近年來NSCLC發病率不斷增高，已成為全球范圍內致死率最高的腫瘤[1]。肺癌因為在早期階段并無顯著的臨床特點和癥狀，也沒有特異性強的檢測手段，很多肺癌患者在確診時已處于發展階段，進而使治療效果和預后受到嚴重影響[2]。為了預防和控制可能的NSCLC發生，檢測NSCLC的生物標志物至關重要，因此要改善NSCLC的診斷準確性。研究發現，微小RNA-503(microRNA-503，miR-503)在NSCLC和肝細胞癌中表達顯著下調，也可通過靶向原纖維蛋白-1促進糖尿病足潰瘍患者的傷口愈合[3-5]。蛋白激酶D(Protein kinase D，PKD)是一種新發現的鈣離子/鈣調蛋白依賴性的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其中蛋白激酶D1(Protein kinase D1，PKD1)是PKD家族研究最深入的成員，在細胞增殖、凋亡、侵襲等一系列生物學行為中起重要調控作用[6]。Wei等[7]研究發現，PKD1在NSCLC患者的癌組織中顯著上調，可能是miR-503的直接靶標。經MirTarBase網站預測，miR-503與PKD1存在結合位點，因此本研究通過檢測NSCLC患者血清中miR-503、PKD1表達水平，分析兩者對NSCLC診斷的臨床意義，以期為NSCLC的臨床診斷提供一定參考。

資料與方法

一、一般資料

收集2016年1月～2018年1月在本院經病理診斷并確診的NSCLC患者61例(試驗組)，另選取同期體檢人群61例作為對照組。兩組患者年齡、性別比較，差異無統計學意義(P>0.05)(見表1)。根據國際肺癌研究協會第八版肺癌TNM分期標準，將患者分為I+Ⅱ期43例，Ⅲ期18例[8]。NSCLC患者納入標準：①有明確的病理診斷結果的NSCLC患者(符合《中國常見惡性腫瘤診治規范·第六分冊·原發性支氣管肺癌》[9])，首次治療或既往治療結束1個月以上；②具有可測量病灶；③患者有完整的臨床資料；④同意遵守醫囑并簽署知情同意書者。排除標準：①合并心、肝等嚴重疾??；②有系統性免疫缺陷癥的患者；③兒童、孕婦和精神病患者；患有膿毒癥、支氣管肺炎等炎癥性疾病。本研究經本院道德倫理委員會批準通過，所有樣品采集均取得患者及家屬知情同意并簽字，符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》。

表1 兩組一般資料比較

二、主要試劑和儀器

低溫高速離心機、Nano Drop 2000(美國Thermo Scientific公司)，熒光實時定量PCR儀(美國Applied biosygtems公司)，Trizol試劑(美國Invirotrogen公司)，逆轉錄試劑盒(北京天根生物科技公司)，SYBR Premix Ex Taq TM試劑盒(大連TaKaRa公司)，-80℃超低溫冰箱(美國Thermo公司)，Milli-Q超凈水凈化系統(美國Millpore公司)，引物由上海生工生物工程有限公司設計并合成。

三、方法

1 樣本采集與保存

所有病理及對照組人員均于清晨空腹抽取外周靜脈血5 mL，靜置30 min，室溫3000 rpm/min，離心15 min，吸取上清液分別裝入EP管中，置于-80℃ 冰箱中保存備用。

2 實時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測對照組及試驗組血清中miR-503、PKD1 mRNA表達

按照Trizol法提取對照組及試驗組血清樣本中總RNA，分光光度計測總RNA純度及濃度，根據逆轉錄試劑盒說明將RNA反轉錄為cDNA。參照SYBR Premix Ex Taq TM試劑盒說明書進行qRT-PCR反應，以U6、GAPDH基因為內參，miR-503、PKD1、U6、GAPDH引物序列(見表2)。反應條件為：95℃，10 min；40 個PCR循環(95℃，10 s；60℃，60 s，72℃，15 s)。采用2-ΔΔCt方法計算NSCLC患者血清中miR-503、PKD1 mRNA相對表達量。

表2 qRT-PCR引物序列

四、統計學分析

采用統計學軟件SPSS 22.0進行數據分析。計量資料以平均數±標準差描述，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數資料以[n(%)]描述，行卡方檢驗。采用Pearson法分析NSCLC患者血清中miR-503、PKD1 mRNA表達的相關性；受試者工作特征曲線(receiver operator characteristic，ROC)曲線評估血清中miR-503、PKD1 mRNA表達水平對NSCLC的診斷價值。當P<0.05時，代表差異有統計學意義。

結 果

一、NSCLC患者血清中miR-503、PKD1 mRNA在對照組及試驗組中的表達

檢測結果顯示，與對照組相比，試驗組miR-503表達水平降低，PKD1 mRNA表達水平升高，二者差異有統計學意義(P<0.05)(見表3)。

表3 miR-503、PKD1 mRNA在對照組及試驗組血清中的表達

二、NSCLC患者血清中miR-503、PKD1 mRNA表達水平與臨床病理特征的關系

以miR-503、PKD1 mRNA表達水平平均值為界值，分為miR-503、PKD1 mRNA低表達組和高表達組。miR-503、PKD1 mRNA表達水平與年齡、性別、分化程度無關，差異無統計學意義(P>0.05)；與組織學類型、淋巴結轉移、TNM分期有關，差異有統計學意義(P<0.05)(見表4)。

表4 miR-503、PKD1 mRNA表達水平與臨床病理特征的關系[n(%)]

三、miR-503 、PKD1 mRNA表達水平的相關性

Mirtarbase網站預測，miR-503與PKD1存在結合位點，Pearson法分析結果顯示，試驗組中miR-503 、PKD1 mRNA表達呈負相關(r=-0.597，P<0.05)(見圖1、2)。

圖1 miR-503與PKD1結合位點

圖2 miR-503 、PKD1表達水平的相關性

四、血清中miR-503、PKD1 mRNA表達水平對NSCLC的診斷價值

血清中miR-503、PKD1 mRNA聯合檢測診斷NSCLC的曲線下面積(area under the curve，AUC)為0.861，敏感度為82.0%、特異性為85.2%(見表5、圖3)。

表5 血清中miR-503、PKD1 mRNA表達水平對NSCLC的診斷價值

圖3 血清中miR-503、PKD1 mRNA診斷NSCLC的ROC曲線分析

討 論

肺癌在我國癌癥中發病率和死亡率均居于首位，每年肺癌發病人數約78.1萬，死亡人數約62.6萬[10]。肺癌的病理分型中NSCLC約占總數的85%，由于在早期缺乏明顯特異性癥狀，同時易發生血行轉移，大多數患者在確診時已進入中晚期階段，治療效果及預后不佳[11]。近年來，隨著肺癌早期篩查技術的普及和治療方式的發展，截止到2015年，我國男性肺癌患者病死率下降了45%，女性肺癌患者病死率下降了19%[12]。對于早期肺癌患者，癌細胞尚未轉移，外科手術切除癌癥組織為最佳治療方式。對于肺癌分期預后較差的患者，需要采取輔助化療、靶向治療、免疫治療等提高生存率。因此，肺癌的早期篩查、診斷和治療對于提高患者的生存率、延長患者壽命十分重要。

近年來研究發現，miR-503與多種癌癥的發生發展有關，其在甲狀旁腺癌和腎上腺皮質癌中過表達[13-14]；在腎上腺癌中，表達上調與患者的總體生存期縮短有關[14]。PKD1基因位于人類染色體14q11位置，在人體內腦、心臟、肺等多個器官中廣泛表達，同時其在維持心肌細胞功能和心血管系統健康及免疫調節方面起到關鍵作用[15]。Liu等[3]證實miR-503在NSCLC患者組織樣本中表達下調，且miR-503異常低表達與患者預后不良有關，是預后不良的獨立危險因素。近年來研究發現，PKD1在多種腫瘤中表達異常，如在前列腺癌、乳腺癌胃癌和胃癌中顯著下調[16]，而過表達PKD1在胰腺癌、皮膚癌的發展中起重要作用[17-18]。本研究發現，與對照組相比，試驗組血清中miR-503表達水平降低，PKD1 mRNA表達水平升高，差異有統計學意義。本研究通過miRtarbase網站預測，miR-503與PKD1存在結合位點。經Pearson法分析，NSCLC患者血清miR-503 、PKD1 mRNA表達呈負相關，提示在NSCLC發展過程中，miR-503、PKD1 mRNA可能存在負反饋調節機制，而miR-503表達水平的降低和PKD1 mRNA表達水平的升高可能加劇了NSCLC的疾病進展。本研究結果顯示，miR-503、PKD1表達水平與年齡、性別、分化程度無關，差異無統計學意義；與組織學類型、淋巴結轉移、TNM分期有關，差異有統計學意義。提示二者表達水平受到疾病的進程影響，也暗示二者參與了NSCLC的發展過程中。ROC曲線分析發現，miR-503、PKD1診斷NSCLC均具有良好的敏感度及特異性，血清中miR-503、PKD1 mRNA聯合檢測診斷NSCLC的AUC為0.861，敏感度為82.0%、特異性為85.2%，兩者聯合診斷價值更高。提示miR-503、PKD1可能共同參與了NSCLC患者的疾病發生發展過程，兩者均具有較高的臨床價值，聯合檢測診斷價值更高。

綜上所述，miR-503 在NSCLC患者血清中低表達，PKD1高表達，二者呈負相關，均可能與NSCLC的發生發展有關，聯合檢測對臨床診斷具有一定參考意義。本研究也存在研究樣本數量偏少，研究深度不夠的不足，miR-503、PKD1在NSCLC患者體內的作用機制有待進一步研究。