肺腺癌免疫組化標記物的臨床應用及其與基因突變關系的研究進展

楊翠林 自寶莉 李萍 周開華

作者單位：1. 650000 云南 昆明，昆明醫科大學附屬甘美醫院 2. 650000 云南 昆明，昆明市第一人民醫院呼吸科

肺癌是最常見診斷和導致死亡的惡性腫瘤之一[1]。非小細胞肺癌(non-small cell lung carcinoma，NSCLC)約占所有肺癌的80%～85%，腺癌(約占40%～50%)和鱗癌(約占20%～30%)是非小細胞肺癌的主要亞型[2-3]。在以前由于治療的局限性，通常不需要對非小細胞肺癌進一步分類，因此在小樣本中很少區分腺癌和鱗癌，隨著靶向治療和免疫治療的發展，不僅改變了治療策略，而且強調將NSCLC進一步分類為特定亞型的重要性[4-5]。在臨床實踐中，超過60%的肺癌患者就診時已是晚期或出現遠處轉移，無法通過手術切除進行形態學診斷，診斷通常僅限于小活檢標本或細胞系標本，而小活檢標本在形態學上往往不足以確定組織學類型。在上述背景下，結合2015年世界衛生組織更新的肺癌亞分類指南，建議使用免疫組化法進一步對非小細胞肺癌精確分類；TTF-1、NapsinA、CK7和CK5/6、P63、P40分別為肺腺癌和鱗癌標記物[3]。本文就肺腺癌免疫組化標記物的臨床應用及其與基因突變關系作一綜述。

一、TTF-1的生物學特征與功能

TTF-1(Thyroid transcription factor-1)是NKx2家族的成員之一，官方全名為(NK-2 homeobox 1 ，NKX2-1)，是一種含有同源結構域的轉錄因子。人類TTF-1由位于14號染色體上的單基因編碼，cDNA克隆實驗表明，TTF-1由三個外顯子和兩個內含子組成，多個轉錄起始點和選擇性剪接產生5′末端具有異質性的mRNAs，3′端有一個較長的非翻譯區[6]。牛、大鼠、小鼠和人類的TTF-1由371-378個氨基酸組成，分子量在38-42kDa之間，它們的氨基酸序列具有98%相似性，60個氨基酸同源結構域完全保持不變[7]，表明TTF-1具有高度的序列保守。

TTF-1在胚胎發生過程中調節甲狀腺、肺和間腦的基因表達，研究表明，敲除小鼠中的TTF-1基因會導致幼崽無法同時出現肺實質和甲狀腺，并且在前腦中具有廣泛的缺陷[8]。肺組織中，TTF-1控制對肺穩定和肺宿主防御至關重要的表面活性蛋白的表達，通過直接與SP-A、SP-B 、SP-C、Clara細胞分泌蛋白(CCSP)和T1的啟動子直接結合來調節表面活性劑蛋白的轉錄，從而確定了肺的譜系特異性發育[9]。

二、NapsinA的生物學特征與功能

Napsin A(novel aspartie proteinase A) 是一種天冬氨酸蛋白酶，基因位于染色體19q13.3上，編碼45 kDa的單鏈蛋白和420個氨基酸，其轉錄產物長度為1 263 bp，Napsin A基因的一級結構由信號肽、前肽區、功能區和C末端四部分組成[10]。Giovanna等[11]研究表明，早在妊娠第12周Napsin A就在胎兒肺腺結構中表達，到妊娠第30周時表達減少，此時Napsin A的表達模式與成人肺相似，Napsin A的表達在病理條件下增加，包括炎癥性疾病和肺發育不全，這大概是為了糾正功能性肺衰竭。Napsin A廣泛分布于肺泡巨噬細胞以及Ⅱ型肺泡表面上皮細胞，負責表面活性劑蛋白B的N端裂解事件，其蛋白水解活性對肺表面活性蛋白的成熟具有誘導作用，以此來維持肺的形態及功能[12]。

三、CK7的生物學特征與功能

CK7(細胞角質蛋白7)的相對分子質量為54 KDa，主要在腺上皮和移行上皮中表達，研究表明，幾乎百分之百的肺腺癌表達CK7，對肺腺癌的診斷具有極高的敏感性，但其特異性較差，大約30%～60%的肺鱗癌也可表達CK7[13]。此外，CK7在乳腺、胃、胰腺、卵巢、子宮上皮等器官和部位發生的腺癌中也可表達,因此,在肺腺癌診斷和鑒別診斷時,需聯合其他特異度較高的抗體如TTF-1、Napsin A共同應用。CK7的表達在肺癌的預后、與肺癌基因突變的相關性尚無研究，它的作用主要在腫瘤的診斷方面。

四、TTF-1與NapsinA在肺癌診斷中的價值

NSCLC分類最常用的免疫組化標記物有TTF-1、Napsin A、CK5 / 6、P63 和 P40 ，這些標記物具有不同的敏感性和特異性[13]。TTF-1被認為是最敏感和最特異的標記物來定義起源于終末呼吸單位(TRU)的腺癌，其表達與腫瘤分化程度成反比，即與高分化腫瘤相比，低分化 腫瘤不太可能表達TTF-1[14-15]，研究表明，約60%～95%的原發性肺腺癌表達TTF-1，肺鱗癌幾乎不表達TTF-1[13,16]。NapsinA是繼TTF-1之后新發現的另一種肺腺癌免疫組化標記物，在約70%～95%的肺腺癌、<3%的鱗癌中表達，而在小細胞癌、大細胞癌、肺神經內分泌腫瘤，不表達或呈低表達[17]。WHO指出，單個肺腺癌標記物(TTF-1、NapsinA)和單個鱗癌標記物(p40、 p63)的免疫染色足以解決大多數非小細胞肺癌的診斷[18]。由于沒有任何一個標記物對肺癌的診斷是完全敏感和特異的，所以需要使用一組抗體來提高診斷的正確率；一般認為，TTF-1/p63 在肺腺癌和肺鱗癌中均是一個陽性而另一個陰性,若患者的TTF-1和P63均呈陰性結果，則認定為腺癌；所有缺乏鱗狀細胞形態并顯示p63和TTF-1共表達的腫瘤最好歸類為腺癌[14,19]。

肺是其他轉移癌常發生的器官之一，原發性肺腺癌常需與轉移性腺癌相鑒別。TTF-1被認為是原發性肺腺癌的可靠標記物，然而，TTF-1在其他器官的腺癌中也可呈陽性，包括結腸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、前列腺癌等[20-21]。NapsinA在Ⅱ型肺泡細胞中的表達可能被TTF-1上調，較早的研究表明，NapsinA是原發性肺腺癌的有用標記物，NapsinA對診斷原發性肺腺癌的敏感性較TTF-1稍高。然而，NapsinA并非肺腺癌所獨有，約79%的乳頭狀腎細胞癌和34%的腎透明細胞癌也可表達。由于單個免疫組化標記物很難鑒別原發性腺癌還是轉移性腺癌，有必要將幾種標記物結合起來；此時，利用肺腺癌特異性的標記物(TTF1和Napsin A)結合乳腺癌標記物(ERα、PR、GCDFP15、mammaglobin和GATA-3)、腎細胞癌標記物(PAX8)、乳頭狀漿液性腺癌標記物(PAX8、PAX2和ER)、胃腸道腺癌標記物(CDX2)和前列腺癌標記物(NKX3.1)等可與轉移性腺癌相鑒別[22]。

總之，TTF-1和Napsin A在原發性肺腺癌中高表達，是肺腺癌的兩個特異性標志物，它們主要用于肺腺癌和肺鱗癌的診斷及鑒別診斷，以及區分原發性肺腺癌和轉移性肺腺癌。

五、TTF-1與Napsin A表達在肺癌患者中生存預后的價值

TTF-1 和Napsin A作為肺腺癌標記物在原發性肺癌診斷和鑒別診斷中的作用已被充分證明，它們的表達與肺癌患者預后的相關研究已經開展，但其在 NSCLC患者中的預后意義仍存在分歧，大多數研究集中在TTF-1，少數研究討論了Napsin A表達與預后的意義。

TTF-1與Ki-67增殖活性呈負相關，提示TTF-1陽性表達，可能具有良好的預后意義。一項動物研究表明，TTF-1的上調與良好的存活率相關，而下調與分化的喪失，腫瘤接種能力的增強和轉移潛能的提高有關[23]。Schilsky等[24]研究表明，TTF-1陽性的患者總生存期明顯長于TTF-1陰性的患者(18個月比9個月，P<0.000 1),在多因素分析中，TTF-1陽性仍然與較好的總體生存率相關(HR=0.38P<0.000 1)。Li等[25]研究了TTF-1在中國晚期肺腺癌患者中的表達對預后的影響，結果顯示，在多變量分析中，TTF-1陽性腫瘤患者的中位無進展生存期明顯長于TTF-1陰性的患者(22.7個月VS 11.8個月，P<0.000 1)，除了評估TTF-1對晚期肺腺癌患者生存預后影響外，還研究了TTF-1陽性表達患者是否比TTF-1陰性患者從培美曲塞化療中獲益更多，結果顯示TTF-1陽性表達并不能預測對培美曲塞化療的療效。一項薈萃分析表明[26]，與TTF-1陰性的非鱗狀非小細胞肺癌患者相比，TTF-1過表達的患者生存率明顯提高(HR=0.49，95%CI:0.42～0.57，P<0.000 01)，亞組分析顯示TTF-1表達與I期(HR=0.65，95%CI:0.50～0.84，P=0.000 8)和Ⅲ～Ⅳ期非小細胞肺癌(HR=0.38，95%CI:0.29～0.49，P<0.000 01)的預后顯著相關。

以上研究表明，TTF-1陽性表達的患者比TTF-1陰性的患者可能有更好的生存率，但TTF-1陽性表達并不能預測對化療的療效。

然而，也有學者認為TTF-1很有可能通過增加腫瘤新生血管的生成從而加速肺癌的發展。生存數據方面，有研究表明[27]，在TTF-1陽性和陰性患者中沒有統計學意義，此研究還分析了TTF-1表達與Ⅳ期肺癌患者的生存結局和化療選擇的關系，并不能確定TTF-1與生存結果或治療選擇之間的任何相關性。TTF-1表達對肺腺癌治療選擇的預測作用有待前瞻性隨機研究的驗證。

NapsinA在II型肺泡細胞中的表達可能被TTF-1上調，目前關于NapsinA的表達和肺癌生存預后之間的研究較TTF-1的少。來自克羅地亞的一項研究表明[28]，Napsin A陰性的患者相對死亡風險高于陽性表達的患者(P=0.036)。Ma等[29]研究表明，NapsinA的表達水平是影響肺癌患者生存的獨立預后因素，高水平的Napsin A表達與生存呈正相關，高表達組和低表達組的5年OS率分別為87.6%和56.3%，多因素分析顯示，Napsin A高表達和TTF-1/Napsin A共同表達是早期肺腺癌患者良好生存的獨立預后因素，早期肺腺癌患者術后應行IHC檢測標本中的NapsinA表達水平，其意義不在于鑒別診斷，而在于能更好的判斷預后。

目前，通過檢測TTF-1與NapsinA的表達來預測生存預后作用未被充分利用，分析原因可能有以下幾個方面。首先，不同研究中對免疫組化染色的質量控制不同，包括抗體的來源、方法的選擇、評分系統的選擇、染色結果的評判標準大不相同。此外，在以往的研究中，樣本量相對較小、隨訪時間短、對組織學和分期缺乏控制，也是影響因素之一。因此，仍需要制定統一的免疫組化染色標準以及在前瞻性隨機研究中得到證實。

六、TTF-1與NapsinA表達與基因突變的相關性

NSCLC存在不同驅動基因的突變，EGFR是目前被研究最全面的基因之一，目前的檢測方法不能在臨床上廣泛普及。因此，鑒定可預測EGFR突變狀態的其他病理標記物在臨床中可能非常有用。日本NEJ002臨床試驗報道[30]，在TTF-1 表達陽性的ADC患者中，EGFR 突變率顯著高于TTF-1陰性表達者，尤其是亞裔、女性和非吸煙者，顯示出較高的EGFR突變率和TTF-1陽性表達率，后續很多研究也發現， TTF-1的表達狀態與肺ADC患者EGFR 突變有關[31-32]。

Wan等[33]研究表明，在97例EGFR突變的患者中，免疫組化TTF-1染色均陽性，而TTF-1陰性或者部分陽性者無一例EGFR突變。一項薈萃分析[34]評估了NSCLC中 TTF-1表達與 EGFR突變之間的關系，結果顯示，與TTF-1 表達陰性的NSCLC相比，攜帶 TTF-1 過表達的患者，表現出更高的 EGFR 突變率(OR=5.19，95%CI：3.60～7.47，P<0.000 01)，TTF-1 的表達與外顯子 19(OR=4.63，95%CI：2.89～7.41，P<0.000 01)以及外顯子21(OR=3.16，95%CI：1.04～9.60)的 EGFR 突變顯著相關(P=0.04)。近期一項研究[32]也表明， TTF-1的表達水平與EGFR突變(P<0.001)呈正相關，隨著TTF-1表達水平增高，突變率也增高，表明不同的TTF-1表達水平具有不同的EGFR突變率。

Li等[31]回顧性研究了339例肺腺癌患者TTF-1、Napsin A的表達與EGFR突變情況，研究發現7.7%的病例為TTF-1、Napsin A雙陰性，且這些病例均未包含 EGFR 突變，這一發現支持使用TTF-1和NapsinA免疫組化結果為雙陰性的病例來識別EGFR突變的患者，在小活檢標本中可以保留有限的組織用于其他輔助測試。此外，有研究發現，肺粘液性腺癌通常無EGFR突變，相反，這些腫瘤最常攜帶KRAS激活突變，而且對TTF-1和Napsin A呈陰性。因此，當鑒定出真正的肺粘液性腺癌時，有學者提出可以避免進行 EGFR突變檢測。

七、TTF-1與NapsinA表達與基因突變相關性研究的意義

EGFR突變在TTF-1、NapsinA陰性表達的肺腺癌中有異常罕見，對EGFR突變有很高的陰性預測價值，當由于腫瘤組織不足、取材困難、費用昂貴等原因無法及時檢測 EGFR突變狀態，或者由于臨床原因需要緊急治療時，TTF-1 、NapsinA免疫組化染色結果在一定程度上可以作為指導EGFR 突變未知的晚期非小細胞肺癌患者抗癌治療的生物標志物。特別是TTF-1陰性表達，可能是肺腺癌患者推薦常規化療的替代指標，在一定程度上彌補了EGFR基因突變檢測的不足。

小 結

公認的肺腺癌免疫組化標記物有TTF-1和Napsin A，它們在非小細胞肺癌的準確診斷和亞分類中具有關鍵作用。但肺癌的發生發展涉及復雜的細胞內信號傳導和各種蛋白質生物標記物的表達，在過去的十多年中，發現了許多肺癌生物標志物，但這些標志物在臨床實踐中并未被充分應用，如果這些良好的生物標記物能用來判斷肺癌預后、監測疾病進展、治療反應以及指導靶向治療等，那么這些指標的臨床意義就會擴大。