HIF-1α與TDAG8在低氧性肺動脈高壓發病中的研究進展

徐海燕 孔玉紅 徐喜媛 楊敬平

作者單位：014010 內蒙古 包頭，內蒙古醫科大學第三附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，內蒙古呼吸與危重癥醫學研究所

肺動脈高壓(PH)是一組臨床特征為肺循環壓力的異常升高，最終導致右心室衰竭和死亡的疾病[1]。根據病理生理機制、臨床表現、血液動力學特征及治療方法，PH在臨床上分類，分為五類[1]。低氧啟動的低氧性肺血管收縮及肺血管重塑，致低氧性肺動脈高壓(Hypoxic pulmonary hypertension，HPH)的形成[2]，為PH分類的第3類[1]。當低氧時肺血管平滑肌受各種調節因素調控，發生肺血管重塑時，表明HPH形成[1-2]。近年來，HIF缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor 1-α, HIF-1α)通過調節血管生成、紅細胞生成、炎癥和增殖的數百種基因，在HPH發病中起關鍵作用[3]。在HPH發病中低氧造成的微酸環境與質子感知受體TDAG8相互作用，發揮重要作用并逐漸引起研究者關注[4]。本文探討HIF-1α及TDAG8在HPH發病中的作用，進一步了解HPH發病新進展。

HPH發病中肺血管收縮及肺血管重塑的研究

HPH的主要改變為低氧引起的肺血管收縮及肺血管重塑[3]，低氧性肺血管收縮的研究較為深入。急性低氧觸發廣泛的肺血管收縮，可導致急性右心室后負荷增加[5]。慢性低氧最初發生肺動脈收縮，從最初的幾個小時就可以啟動缺氧性肺血管重塑的網絡化病理生理學改變；隨著低氧時間延長，發生肺動脈重塑的病理改變，成為HPH的標志并決定了HPH的嚴重程度[5]。病理改變主要為平滑肌細胞增殖和肥大，膠原蛋白和彈性蛋白等細胞外基質蛋白沉積增加，外膜或循環細胞的募集等[5]。

HPH肺血管重塑中，肺動脈內皮細胞(pulmonary artery endothelial cells, PAEC)與肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMC)之間相互作用，導致病變發生及進展[6]。PAEC具有屏障和分泌作用，急性缺氧時整個肺血管床發生血管收縮，其中，無肌肉末端小動脈、毛細血管和小靜脈等微血管區域的PAEC收縮 ，根據泊肅葉定律，將導致血管阻力增加了34%[7-8]。低氧誘導的內皮源信號發生TRPC6的移位，同時激活PLC和RhoK觸發PASMC收縮。這種傳導以肌內皮連接的形式存在，該連接允許去極化或超極化在相鄰的內皮細胞和平滑肌細胞之間擴散，并促進蛋白質信號在內皮細胞和平滑肌細胞之間傳導[7-8]。使用磁共振成像發現低氧時PAEC作為相鄰層流變化和非層流血流變化的傳感器，導致剪切應力的變化引起PAEC從基因表達的改變到引起一系列內皮功能的改變，如ROS引起RhoA / ROCK的激活、內皮一氧化氮合酶(eNOS)合成異常、釋放血管活性介質及多種生長因子，激活HIF-1α表達，均影響平滑肌的生長，導致血管重塑[7-8]。HPH患者的PAEC對生長因子有高度增生作用，并表現出很高的糖酵解率，形成局部微酸環境，調節質子感知受體的表達，并誘導炎癥反應發生[8]。研究表明，PAEC暴露于高水平的剪切應力下，三周會導致高度增殖的表型的發展，并減少細胞凋亡,并誘導炎癥反應發生[8-9]。其中，HIF-1α為近年來在HPH發病中研究的熱點，在肺血管重塑中起關鍵作用。

HIF-1α在HPH發病中的研究進展

大量研究證明，HIF-1α可以通過調控PASMC細胞內離子、離子通道及pH值平衡，調節血管生長因子和Warburg效應(Warburg effect)及誘導炎癥反應影響平滑肌增殖。

急性缺氧導致PASMC細胞內鈣離子增加，導致血管收縮，常氧后可恢復正常。慢性缺氧時鈣離子通道因細胞內鈣離子存儲的耗竭而激活，鈣離子內流增加，PASMC中基線鈣離子升高，在恢復常氧后也不能回復[10]。研究表明[10-11]，PASMC膜中K+通道的開放會增加K+流出，從而引起膜超極化。這關閉了電壓依賴性Ca2+通道，減少了Ca2+的進入并導致血管舒張。相反，抑制K+通道會導致膜去極化，Ca2+進入，細胞收縮和血管收縮。細胞外酸中毒和低氧下調或抑制KCNK3基因(編碼外向K+通道)導致PASMC去極化,Ca2+進入產生肺動脈血管收縮并通過激活Ca2+敏感通路使PASMC增殖。小鼠神經母細胞瘤細胞KCNK3基因敲低，可使增殖率增加25%，藥理抑制或基因干擾KCNK3可以通過HIF1-α和ERK1/2、AKT和SRC的磷酸化，激活促進PASMC增殖和抗凋亡[11-12]。研究表明：缺氧小鼠的PASMC中，與鈣離子相關的瞬時受體電位TRPC1和TRPC6 蛋白表達均增加[3]；ET-1表達增高可以增加TRPC1 / TRPC6表達，并抑制了電壓依賴型鉀通道Kv 1.5和Kv 2.1 mRNA和蛋白表達[13]，進行HIF-1α+/-處理后，小鼠在慢性缺氧時PASMC內基線鈣離子及TRPC1/TRPC6表達并沒有增加[3, 13-14]。研究發現：Na(+)/ H(+)交換物(NHE)在慢性低氧小鼠PASMC中的表達和活性增加，并導致PASMC中的pH增加，有助于PASMC肥大和增生信號傳導途徑的激活，這一過程可以被HIF-1α調節[15]。

HIF-1α激活編碼血管生成生長因子的轉錄，HIF-1α直接與編碼VEGF，基質細胞衍生因子(stromal-derived factor 1，SDF-1)，血管生成素2(Angiopoietin 2，ANGPT2)和干細胞因子(Stem cell factor, SCF)的基因的啟動子中的結合反應原件結合[16-17]。血管生成生長因子(以VEGF為主)依賴性于HIF-1α刺激內皮細胞為主的多種血管細胞，這些細胞均有同源受體(VEGFR1或VEGFR2)表達,促血管生成[16]。血管內皮生長因子A(VEGF-A)，其關鍵的調節途徑之一是表皮生長因子受體(EGFR)信號傳導途徑。它可以通過VEGF及NDRG3/Raf-ERK途徑促進血管重塑[16-17]；調節EGFR信號通路的VEGF表達的主要下游通路是PI3K-AKT，RAS-MAPK和JAK信號轉導子和轉錄激活子(STAT)信號轉導通路。這三個轉錄因子與VEGF-A mRNA的啟動子結合，然后促進VEGF-A mRNA的表達并增加VEGF-A的分泌[17]。調節該下游信號傳導途徑的重要因子是HIF-1α、STAT及轉錄因子第二成分1(SP1)[16-17]。

HPH的PAEC也會發生從氧化代謝到糖酵解的HIF-1α依賴性重編程。HIF-1α還可通過Warburg效應，促進PASMCS增殖。低氧條件下導致HIF-1α的積累，抑制了丙酮酸進入線粒體完成氧化磷酸化，大部分通過細胞質中乳酸脫氫酶轉化為乳酸。研究表明[18]，PDGF可通過PI3K/AKT/mTOR/HIF-1α信號轉導通路，增強Warburg效應促進PASMC增殖，參與肺動脈高壓的形成。乳酸可通過低氧誘導因子HIF-1α誘導巨噬細胞向M2型極化，促進VEGF的表達，產生增殖作用[18]。

炎癥也參與了HPH的發病，低氧及HIF-1α均可參與先天免疫及獲得性免疫的調節。T細胞受體/ CD3抗原復合物可激活HIF-1α表達。細胞葡萄糖代謝和脂肪代謝在T細胞分化為輔助性T細胞17 (helper T cells17，Th17)/調節性T細胞的過程中起著重要作用，HIF-1α調節Th17細胞/調節性T細胞之間的平衡[19]。輔助性T細胞17和維持/調節性T細胞失衡可通過ROCK信號通路影響STAT3/STAT5磷酸化,導致PASMCS的增殖[19]。在慢性低氧時，大鼠血清IL-6的增加，并通過JAK2 / STAT3途徑的激活誘導MMP-9的上調；STAT3抑制劑可下調MMP-9表達，并減弱缺氧誘導的微血管變化，表明IL-6/JAK2/STAT3/MMP-9途徑參與低氧微血管增殖調節及肺血管重建[20]。NF-κB的活性受NF-κB(IκB)激酶(IKK)抑制劑(主要是IKKβ)的調節，以響應感染性或炎性刺激。在缺氧條件下，NF-κB有助于增加HIF-1α mRNA的轉錄,HIF-1α介導了缺氧條件下的中性粒細胞的NF-κB激活和促進NF-κB調節的細胞因子TLR4的表達。低氧情況下，缺氧誘導因子HIFα和HIF-β亞基移位至細胞核，以異二聚體的形式與缺氧反應啟動子元件(HRE)結合，誘導多基因的轉錄，包括NF-κB和TLRs的表達[21]。在MDSC(髓樣來源的抑制細胞)中，低氧條件下，HIF-1α與PD-L1(程序性死亡配體)近端啟動子中的缺氧反應元件(HRE)結合，直接靶向，使細胞產生IL-6、IL-10[22]。許多研究證實，丙酮酸激酶在糖酵解中具有關鍵作用，在LPS活化的巨噬細胞中可通過HIF-1α調節IL-1β表達[23]。研究表明：低氧時PAEC上調IL-33及其受體ST2表達，以ST2依賴性方式激活HIF-1α/ VEGF軸，引發血管平滑肌細胞重塑[24]。

HIF-1a可通過不同信號轉導通路進行自身調節。研究發現[25]，已知HIF-1a受生長因子、細胞因子和細胞分裂素的調節，低氧條件下，可通過MAPK/ERK、PI3K/AKT/mTOR、cAMP/PKA、NF-kB等通路可誘導HIF-1a的活化。研究證實HIF-1α的表達依賴于表皮生長因子。表皮生長因子與表皮生長因子受體，激活PI3K/aKT信號通路，誘導HIF1α的穩定表達。在低氧環境下，EGFR/Akt/mTOR通路是已知的HIF1a的正向調節因子。有研究表明,FAT1是跨膜蛋白,定位在人類染色體4q34-35上，缺氧條件下FAT1在HIF-1a表達中的上游起調控作用[17, 25]。

質子感知受體TDAG8的作用及在HPH發病中的研究進展

G蛋白偶聯受體家族(G Protein-Coupled Receptors，GPCRs)是一類膜蛋白受體的總稱，包括OGR1、GPR4、G2A和TDAG8等質子感知受體，這類受體在正常組織細胞包括心、腦、肺、腎等臟器及人的各種腫瘤細胞中廣泛分布，被細胞外酸化激活，促進離子穩態和對穩態干擾(如酸堿平衡)的適應性反應，其中的GPR4和TDAG8對質子感知最強[4]。膜蛋白受體上，大多數蛋白質的可電離殘基在pH 5～7.4之間恒定帶電，對生理pH值變化不敏感，GPCR包含可電離的殘基傳感器(pH傳感器)，包括天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、精氨酸和賴氨酸五個氨基酸可以檢測質子，這些殘基可響應生理pH的變化而不充電，從而調節蛋白質的結構并轉導細胞外質子信號，以激活細胞內信號傳導途徑，并引發適當的細胞應答[26]。TDAG8的pH傳感器以酸性三聯體的出現，并且GPR4和GPR68都可以通過受體胞外域上、組氨酸殘基調節三聯體，誘導構象變化，激活G蛋白和下游信號傳導，調節炎癥反應及平滑肌增殖[26]。細胞可以通過多種分子傳感器來感知細胞外酸化，如酸敏感離子通道(ASIC)，瞬時受體電位和質子感知受體(TDAG8及OGR1)激活多個G蛋白信號通路和下游信號傳導，引起肺血管收縮及肺血管重塑[4,26]。TDAG8在酸性環境中敏感度最高，且在受體內廣泛分布，參與介導多個信號轉導通路，是目前值得關注的明星受體[4]。酸中毒對質子感應GPCR的激活可轉導多個下游G蛋白信號通路，四個GPCR中的每一個都與一個或多個G蛋白偶聯：GPR4(Gs，Gi/o，Gq /11和G12/13)，GPR65(Gs)，GPR68(Gs和Gq /11)和GPR132(Gs和G12/13)[4,26-27]。研究表明，TDAG8主要分布在增殖細胞核抗原(PCNA)陽性的血管平滑肌細胞中，TDAG8基因沉默可以抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移，在過表達TDAG8的血管平滑肌細胞中，cAMP水平升高且促進其增殖，表明TDAG8通過cAMP / PKA信號通路影響血管的重塑[28]

缺氧和炎癥在以多種方式相互影響，炎癥可由缺氧引起的，缺氧通過調節HIF-1α加重炎癥，通過Warburg效應使葡萄糖代謝為乳酸產生局部組織微酸環境，酸性環境不僅是炎癥的結果，還誘導病理差異轉錄程序相關基因產生促炎細胞因子表達，進一步調節生長因子、影響凋亡，導致肺血管平滑肌增殖[18,29]。Vallière研究團隊發現，缺氧通過HIF-1α的穩態來改變厭氧葡萄糖組織代謝中pH的表達，正向調節GPCR的表達，證實了HIF-1α對GPCR的表達有調節作用[30],且可通過Warburg效應促進PASMCS增殖[18]。TDAG8在巨噬細胞、中性粒細胞以及T細胞和B細胞分布廣泛，可調節巨噬細胞中胞外酸化誘導的炎性細胞因子、中性粒細胞中超氧陰離子的產生和嗜酸性粒細胞的存活反應[28-29]，TDAG8與Gs結合激活腺苷酸環化酶(adenylate cyclase，AC)，磷酸化的cAMP反應元件結合(pCREB)蛋白水平上調，通過PI3K-AKT信號通路及NF-KB信號通路調節炎癥細胞的凋亡，并通過前述的炎癥機制參與HPH發病過程[19-22，29,31-32]。研究表明，TDAG8通過趨化因子的產生及調節炎癥水平影響肺血管重塑，例如影響C-C基序趨化因子22配體(CCL22)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-25的表達[33]。研究表明，TDAG8在HPH大鼠肺組織、肺血管和外周血明顯組增加，且校正分析結果進一步提示TDAG8在肺組織、肺血管和外周血中具有高表達一致性。該研究表明，HPH模型大鼠TDAG8通過不同途徑調節CCL22、TNF-α、IL-25表達[33]。CCL22參與免疫調節和炎癥過程，與趨化因子受體CCR4結合，激活T淋巴細胞等，TNF-α與促炎細胞因子的產生有關，IL-25通過Th2淋巴細胞誘導NF-κB、IL-5、IL-8等炎癥因子細胞導致炎癥反應，參與了HPH的發生[33]。表明TDAG8通過缺氧誘導的炎癥反應在HPH發病中起重要作用。PAEC攝取的乳酸可激活上調IL-8依賴性的PASMC增殖，并且乳酸使HIF-1α上調，促進VEGF相關PASMC增殖[34]。實驗表明：低氧導致的酸性環境中，TDAG8顯著促進了HIF-1a的表達,HIF-1通過羧酸轉運體( monocarboxylate transporters，MCTs)，將乳酸轉運出細胞，造成細胞外的酸性微環境，從而誘導酸性環境敏感質子感知受體TDAG8表達激活，由此形成HIF-1α及TDAG8的正反饋通路，共同在HPH發病中起作用[34-35]。上述研究表明TDAG8在低氧及酸性環境中對HPH發病起重要作用，HIF-1α與TDAG8相互調節在HPH發生發展中起重要的作用。

目前，有關HIF與TDAG8相互作用調節HPH的研究較少，但由于低氧導致的微酸環境中，TDAG8可以調節多種肺血管變化，必然與HPH主要的調節因素HIF產生相互作用，對于HIF-TDAG8相互影響的探討將有助于開拓HPH發病機制研究新思路。