外泌體在肺癌診斷中的應(yīng)用研究

郝昱 徐興祥

作者單位：225000 江蘇 揚(yáng)州，蘇北人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科

肺癌是全世界發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，一直威脅著人類(lèi)的健康，四分之一的癌癥死亡是肺癌，大多數(shù)肺癌確診時(shí)已是晚期階段，5年相對(duì)生存率僅有大約16%～19%[1]。肺癌的傳統(tǒng)治療方法是基于組織活檢中癌細(xì)胞的組織病理學(xué)分析，但因?yàn)槠溆袆?chuàng)性，患者需要承擔(dān)較大的風(fēng)險(xiǎn)，因此，尋找有效的肺癌早期篩查手段已成為一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。外泌體作為液體活檢其中的一種成分，因其獲取的非侵入性、可重復(fù)性、成本低等優(yōu)點(diǎn)用于診斷肺癌已經(jīng)成為一個(gè)研究熱點(diǎn)話題[2-3]。目前已經(jīng)有研究表明，外泌體在肺癌發(fā)生發(fā)展的腫瘤微環(huán)境、肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)節(jié)、參與放化療抵抗中，分別都發(fā)揮著重要作用。尤其是外泌體所含的蛋白質(zhì)、miRNA等成分已經(jīng)研究證實(shí)對(duì)于肺癌的早期診斷有重要價(jià)值，具有作為新的早期診斷標(biāo)記物的潛力。本文主要將從外泌體作為液體活檢標(biāo)記物在肺癌中的生物學(xué)作用與應(yīng)用于肺癌方面進(jìn)行綜述。

外泌體概述

在人體的多種體液中都能夠發(fā)現(xiàn)外泌體的存在，例如腦脊液、唾液、胸腔積液、乳汁、腹水、血液、精液、尿液等。外泌體來(lái)源于晚期的內(nèi)吞體，又稱為多囊泡體,(multivesicular bodies, MVB) , 是體內(nèi)活細(xì)胞通過(guò)內(nèi)吞-融合-外排等一系列生物學(xué)過(guò)程而形成的具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的多囊泡體, 它們的直徑大約在30～100 nm，密度在1.13～1.19 g/m1。外泌體的生物成分中含有蛋白質(zhì)、核酸(DNA、mRNA、miRNA、其他非編碼RNA)、脂質(zhì)等[4-5]。外泌體最初是在1987年，Johnstone 等人在研究網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟的過(guò)程中，對(duì)綿羊紅細(xì)胞上清液進(jìn)行超速離心時(shí)發(fā)現(xiàn)的[6]。最初人們認(rèn)為外泌體是細(xì)胞丟棄的“垃圾”，在1995年Raposo等人發(fā)現(xiàn)被EB 病毒感染的 B 淋巴細(xì)胞釋放的外泌體攜帶了適應(yīng)性免疫應(yīng)答所需要的膜結(jié)合分子[7]。從而發(fā)現(xiàn)外泌體可能具有改變細(xì)胞外微環(huán)境、呈遞抗原、刺激T細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)等功能。

一、外泌體的生物發(fā)生

外泌體生物發(fā)生最重要的一個(gè)機(jī)制是ESCRT依賴機(jī)制，ESCRT是由四種蛋白質(zhì)復(fù)合物和輔助蛋白質(zhì)組成(ESCRT-0、ESCRT-I、ESCRT-II、ESCRT-III和Vps4)。這一機(jī)制的過(guò)程包括從內(nèi)芽形成細(xì)胞內(nèi)小體，到多泡小體的產(chǎn)生，到多泡小體的融合成有質(zhì)膜的細(xì)胞體，然后將外泌體釋放到胞外[8]。外泌體形成的另一個(gè)機(jī)制涉及到神經(jīng)酰胺的合成，它誘導(dǎo)囊泡彎曲和出芽[9]。外泌體生物發(fā)生的第三種機(jī)制是四跨膜蛋白介導(dǎo)的特定蛋白質(zhì)組織，如淀粉樣蛋白和前黑質(zhì)體蛋白[10]。

二、外泌體的主要成分

已知的一些數(shù)據(jù)庫(kù)，如ExoCarta (http://www.exocarta.org)給出了外泌體各種成分較為全面的表述，已研究出外泌體含有41 860種蛋白質(zhì)、3 408種mRNA、2 838種miRNA和1 116種脂質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)外泌體中存在多種蛋白質(zhì)，它們能參與外體的生物發(fā)生(ESCRT復(fù)合物，Alix，TSG101)、抗原提呈(抗原提呈因子)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)和融合(Rab GTPases和膜聯(lián)蛋白)，外泌體還富含熱休克蛋白(HSP70、HSP90)、整合素、四磷酸腺苷(由CD63、CD9、CD81、CD82和四種跨膜蛋白組成的超家族，它們通常被認(rèn)為是外泌體標(biāo)記)、MHC Ⅱ類(lèi)蛋白、上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)和人類(lèi)表皮受體家族成員[11-12]。另外外泌體中主要含有膽固醇(CHOL)、鞘磷脂(SM)、磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)、二酰甘油(DAG)、磷脂酸(PA)、磷脂酰肌醇(PI)等多種脂質(zhì)成分[13]。miRNA是一系列內(nèi)源性的非編碼小核糖核酸分子(18～22個(gè)核糖體)，與mRNA的3′UTR結(jié)合引起靶mRNA的降解或者翻譯抑制。miRNAs可以通過(guò)外泌體主動(dòng)分泌并傳遞給其他細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，從而保護(hù)它們不被降解。外泌體miRNAs能在新的受體細(xì)胞中有效地發(fā)揮作用。外泌體的miRNA譜與原發(fā)性腫瘤的miRNA譜具有相似性，外泌體miRNAs的特征可能反映了原始腫瘤細(xì)胞的特征，有作為生物標(biāo)記物的潛能[14]。

外泌體在肺癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)作用

1)促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)：來(lái)自缺氧的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)的外泌體miR-193a-3p、miR-210-3p和miR-5100通過(guò)激活STAT3信號(hào)誘導(dǎo)的EMT，促進(jìn)了肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[15]。2)刺激血管生成：來(lái)自于人類(lèi)肺癌A549細(xì)胞的外泌體分揀蛋白(Sortilin)是外泌體在細(xì)胞通訊介導(dǎo)中的關(guān)鍵成分，它與原肌球蛋白相關(guān)激酶B(TrkB)、表面生長(zhǎng)因子受體(EGFR)組成的TrkB-EGFR-sotilin復(fù)合物也叫做TES復(fù)合物，這種復(fù)合物在體外有遷移和激活內(nèi)皮細(xì)胞的功能，從而在促進(jìn)肺癌血管生成中發(fā)揮重要作用[16]。3)在肺癌微環(huán)境中調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)：腫瘤來(lái)源的外泌體可以與體內(nèi)的免疫系統(tǒng)的正常細(xì)胞相互作用，使產(chǎn)生抑制正常免疫作用的異常細(xì)胞增多，使抗原提呈細(xì)胞(APC)減少、抑制T細(xì)胞及NK細(xì)胞，從而導(dǎo)致免疫監(jiān)視減少，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移侵襲[17]。外泌體在肺癌的免疫逃逸過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。4)促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成：研究者從原發(fā)性小鼠肺癌細(xì)胞中收集了外泌體，并從中分泌出RNA，通過(guò)II型肺泡上皮細(xì)中的NF-κB和MAPK途徑使TLR3(Toll樣受體3)表達(dá)上調(diào)，促使趨化因子產(chǎn)生和中性粒細(xì)胞聚集，進(jìn)而促進(jìn)轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成[18]。

外泌體在肺癌早期診斷中的作用

組織活檢一直作為肺癌診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是其具有創(chuàng)傷性大、依從性差、操作過(guò)程復(fù)雜等缺點(diǎn)。外泌體作為一種液體活檢技術(shù)的檢測(cè)標(biāo)記物能夠在人體的多種體液中獲取，有效的反映其親本細(xì)胞，具有創(chuàng)傷性小、樣本易獲取，并且能夠?qū)崿F(xiàn)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。外泌體的各種生物成分，如miRNA、蛋白質(zhì)等在肺癌中存在異常表達(dá)，外泌體的這些生物成分具有作為肺癌診斷標(biāo)記物的巨大潛力。

一、外泌體蛋白作為肺癌診斷的標(biāo)記物

ADAM是一種去整合素和金屬蛋白酶，Yoneyama等人的一個(gè)首次將酶特異性蛋白水解活性作為潛在的癌癥生物標(biāo)記物的研究利用PrAMA(蛋白水解酶活性矩陣分析)推斷ADAM10sa(ADAM10 sheddase activity)在非小細(xì)胞肺癌患者的外顯體上選擇性增加，這不僅能準(zhǔn)確區(qū)分NSCLC腫瘤患者與健康人，而且能準(zhǔn)確區(qū)分NSCLC腫瘤患者與炎癥性或良性腫瘤性肺病患者，因此，此種蛋白質(zhì)可作為一種重要的NSCLC檢測(cè)生物標(biāo)記物[19]。為了驗(yàn)證外泌體蛋白作為生物標(biāo)志物的潛力，研究者選擇了一組高表達(dá)的蛋白，結(jié)果表明，在LLC胞體中CDK1和CDK3含量較高，KRAS在這三種類(lèi)型的癌細(xì)胞的外泌體中均含量豐富，而PPP1CA和CDC42在三種細(xì)胞中均未檢測(cè)到[11]。外泌體蛋白質(zhì)的種類(lèi)繁多，針對(duì)肺癌診斷的特異性研究較少，不同體液來(lái)源的外泌體蛋白質(zhì)都具有作為肺癌標(biāo)記物的潛能，值得期待的是多種外泌體蛋白質(zhì)組成的聯(lián)合標(biāo)記物將具有較高的臨床價(jià)值。

二、外泌體miRNA作為診斷標(biāo)記物

miRNA被包裹在微泡或者外泌體中使其能夠穩(wěn)定的存在于體液中，對(duì)miRNA的研究分析能夠反應(yīng)親本細(xì)胞的狀態(tài)。研究者對(duì)12例NSCLC患者和6名健康者的血漿進(jìn)行外泌體分離，通過(guò)qPCR技術(shù)分析了在NSCLC中選擇的8個(gè)被解除調(diào)控的特異性miRNA，發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血漿選擇的外泌體miRNA相對(duì)于正常健康人的表達(dá)上調(diào)或者下調(diào)。由此可見(jiàn)NSCLC患者血漿外泌體miRNA可以作為一種疾病診斷工具[2]。實(shí)驗(yàn)通過(guò)同時(shí)檢測(cè)8種血清miRNA和相應(yīng)的血清外泌體miRNA，發(fā)現(xiàn)了4種血清miRNA(miR-21-5p，miR-1413p，miR -222-3p，miR-486-5p)和2種血清外泌體miRNA(miR-146a-5p的和miR-486-5p)在NSCLC的早期患者中具有診斷價(jià)值，進(jìn)一步研究證明血清外泌體miR-146a-5p和miR486-5p在早期NSCLC診斷中的表現(xiàn)優(yōu)于其相應(yīng)的血清miRNA和其他6種血清miRNA，由此可見(jiàn)在早期NSCLC診斷中血清外泌體miRNA比血清miRNA可能更有價(jià)值[20]。隨著對(duì)液體活檢技術(shù)的不斷探索，很多研究證實(shí)，來(lái)源于肺癌的外泌體相關(guān)miRNA在肺癌診斷中有巨大潛力，但是目前來(lái)看針對(duì)肺癌的外泌體特異性miRNA還很少，外泌體特異性miRNA或者多種miRNA組合作為有效的篩查手段還在進(jìn)一步的探索狀態(tài)，需要更多的實(shí)驗(yàn)及密切結(jié)合臨床來(lái)驗(yàn)證。

外泌體與肺癌的治療與耐藥

研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用不含IFN-γ的樹(shù)突狀細(xì)胞來(lái)源的外泌體治療晚期NSCLC時(shí)，外泌體能夠發(fā)揮自然殺傷(NK)細(xì)胞的功能，隨之進(jìn)行的Ⅱ期試驗(yàn)，更進(jìn)一步驗(yàn)證了外泌體可以在NSCLC患者體內(nèi)增強(qiáng)NK細(xì)胞抗腫瘤免疫性的能力[21]。研究者發(fā)明了一種用于肺癌治療的金納米顆粒-外泌體(Exo-GNP)的治療性藥物傳遞系統(tǒng)——“nanosomes”，該系統(tǒng)由通過(guò)物理上負(fù)載在外泌體上的pH可裂解鍵與抗癌藥阿霉素(Dox)偶聯(lián)的GNP組成，該系統(tǒng)的使用比單獨(dú)使用Dox相比，具有更快的藥物釋放速率，更低的化療毒性，從而使化療效果增強(qiáng)[22]。不管是固有的還是獲得性的化學(xué)療法產(chǎn)生耐藥性，是癌癥治療中最基本的問(wèn)題之一，并引起局部和遠(yuǎn)處的腫瘤復(fù)發(fā)以及疾病進(jìn)展。外泌體作為細(xì)胞間傳遞信息的信使，研究發(fā)現(xiàn)它在肺癌藥物治療過(guò)程中產(chǎn)生耐藥方面也存在它的身影。在非小細(xì)胞肺癌中攜帶T790M突變的EGFR-TKI耐藥細(xì)胞H1975釋放的外泌體miRNA-522-3p通過(guò)激活PI3K/AKT途徑將耐藥特性傳遞給EGFR-TKI敏感細(xì)胞PC9，抑制吉非替尼的治療作用、促進(jìn)PC9細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥，并促進(jìn)體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)[23]。

總 結(jié)

隨著人類(lèi)醫(yī)療水平的進(jìn)步，肺癌的發(fā)病率仍然持續(xù)升高，這與肺癌的發(fā)病因素復(fù)雜密切相關(guān)。盡管肺癌的診斷技術(shù)及治療方案較以往有了較大的進(jìn)展，但是肺癌的診斷難度大、治療效果不佳，仍然是困擾我們的一大難題，因此尋找更多簡(jiǎn)便有效的肺癌診斷及治療方法是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。外泌體作為一種新型的液體活檢標(biāo)記物，因其包含多種蛋白質(zhì)、核酸等生物成分，可以在細(xì)胞之間起到細(xì)胞間通訊及調(diào)節(jié)細(xì)胞各種生理反應(yīng)等重要作用，肺癌細(xì)胞也可以利用外泌體這種細(xì)胞間信息傳遞的功能幫助構(gòu)建一個(gè)良好的細(xì)胞生存的微環(huán)境來(lái)支持肺癌細(xì)胞自身的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移侵襲以及對(duì)治療的抵抗。因此外泌體可能作為肺癌早期診斷、治療過(guò)程及判斷預(yù)后的動(dòng)態(tài)標(biāo)記物。近年來(lái)對(duì)于外泌體有關(guān)的生物活性物質(zhì)的研究越來(lái)越多，但是大部分仍處于實(shí)驗(yàn)階段，面臨許多問(wèn)題，如樣本數(shù)量受限、標(biāo)本選擇存在爭(zhēng)議、外泌體分離及提純的標(biāo)準(zhǔn)不確定等。外泌體在肺癌中的應(yīng)用應(yīng)該密切結(jié)合臨床實(shí)際情況，全面了解外泌體在肺癌中的發(fā)生作用的機(jī)制等，相信隨著未來(lái)研究的進(jìn)展，外泌體的各種生物成分有望成為幫助診斷肺癌的生物標(biāo)記物，并且在肺癌的治療及預(yù)后方面有著巨大的潛力。