雞血藤對骨質疏松性骨折大鼠內固定術后恢復的作用及機制*

丁徐 趙毅 黃濤 宋登新

(上海市第一人民醫院寶山分院骨科，上海 200940)

骨質疏松癥是一種全身性、代謝性骨骼系統疾病，與年齡、性別、種族等因素密切相關，骨折是骨質疏松癥最嚴重的后果[1-4]。雞血藤來源于豆科植物密花豆的干燥藤莖，具有促進骨折愈合、抗關節炎、促進血管生成等作用[5-8]。Wnt/β-catenin信號通路是細胞生長發育過程中重要的信號轉導通路，近年研究表明，Wnt/β-catenin信號通路與骨折的愈合密切相關，激活Wnt/β-catenin信號通路能夠促進骨折的愈合，使成骨細胞的數量增加，促進新骨的生成[9-13]。本文通過研究雞血藤對骨質疏松性骨折大鼠內固定術治療后恢復的作用及對大鼠體內Wnt/β-catenin信號通路的調節作用，為骨質疏松性骨折的治療提供新的參考和依據，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級成年雌性SD大鼠，6周齡，體質量(180±20)g，購于中科院上海實驗動物中心[許可證號：SCXK(瀘)2017-0001]，動物房溫度(22±2)℃，濕度(50±10)%，適應性喂養1周后進行實驗。

1.2 主要儀器與試劑 雞血藤提取物(10∶1)購自武漢市恒沃科技有限公司；雙能 X 線骨密度測量儀購自美國GE公司；IN STRON 3367電子拉伸試驗機購自英國英斯特朗公司；雙垂直電泳儀、轉印電泳儀、凝膠成像儀均購自伯樂生命醫學產品有限公司；LRP5、β-catenin、Runx2及GAPDH抗體均購自武漢三鷹生物技術有限公司；RIPA蛋白裂解液、ECL顯色液購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 骨質疏松大鼠模型的建立 將60只大鼠隨機分為對照組、模型組、雞血藤低劑量組、雞血藤中劑量組及雞血藤高劑量組5組，每組12只。除對照組外，其余大鼠采用大鼠卵巢摘除法建立骨質疏松大鼠模型[14]，具體方法為：腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)對大鼠進行麻醉后，采用背側入路，常規備皮、消毒后，取后方髂骨嵴上2cm，脊柱旁1cm處做長約2cm縱行切口，依次切開皮膚，皮下和肌層，暴露腹腔，沿輸卵管尋找到卵巢組織后，嚴密結扎輸卵管并切除卵巢，逐層間斷縫合，術后肌肉注射給予每只大鼠80萬U青霉素預防感染，對照組不做處理，然后所有大鼠繼續飼養8周，期間大鼠自由飲食。造模結束后應用雙能X線骨密度測量儀，檢測所有大鼠骨密度，以評價骨質疏松大鼠模型建立是否成功。

1.3.2 骨折大鼠模型的建立及給藥 骨質疏松大鼠建模成功后，參照文獻方法[15]，除對照組外，其余所有大鼠行右大腿中段外側縱向皮膚切口，長約3cm，暴露股骨干，在股骨干中段用線鋸鋸斷成橫行骨折，用電鉆以直徑1.0mm克氏針從骨折端鉆入遠端，穿出股骨髁，復位骨折，從近折端打入克氏針，截斷多余克氏針，逐層間斷縫合,術中注意保護坐骨神經和肌肉組織，術后肌肉注射給予每只大鼠80萬U青霉素預防感染，對照組不做處理。術后第二天開始，雞血藤低、中、高劑量組根據大鼠體重分別按照50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg灌胃給予大鼠雞血藤提取物，對照組及模型組灌胃給予等量生理鹽水，所有組別每天給藥1次，連續給藥8周，最后一次給藥24h后進行后續實驗。

1.3.3 大鼠骨密度的測定 給藥結束后，以大鼠右側股骨骨折端2.0mm×2.0mm 為中心區域，使用DPX-ALPHA LUNAR TM1通過雙能X射線吸收測定法(DEXA)在Hi-res、small animal模式下測量骨痂骨密度。

1.3.4 大鼠股骨生物力學測定 參考文獻方法[16]，所有大鼠禁食12h后，腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉后腹主動脈取血處死，取大鼠右側股骨標本，去除克氏針后，進行三點彎曲試驗，加載速度為2 mm/min，計算機記錄載荷-位移曲線，然后讀出最大載荷和抗彎強度。

1.3.5 蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosin staining，HE染色) 大鼠處死后，將右側股骨骨折端放入4%中性甲醛中固定48h，脫鈣液脫鈣處理，每周更換一次脫鈣液，共脫鈣5周，進行常規石蠟包埋，于正中矢狀面進行4μm連續切片。然后進行常規HE染色，在顯微鏡下進行組織病理學觀察。HE染色步驟：①脫蠟:將石蠟切片依次置于二甲苯(Ⅰ)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min。②復水：依次置于100%乙醇2 min→95%的乙醇1 min→80%乙醇1 min→75%乙醇1 min→蒸餾水洗2 min，各兩次,然后把水吸干。③蘇木精染色：置于蘇木精溶液中2 min，自來水流水沖洗，2 min，把水吸干。④分化：1%鹽酸乙醇分化30 s，自來水浸泡15 min，吸干水。⑤伊紅染色:置于伊紅溶液中2 min。⑥脫水:依次置于95%乙醇(Ⅰ)5 min→95%乙醇(Ⅱ)5 min→100%乙醇(Ⅰ)5 min→100%乙醇(Ⅱ)2 min。⑦封片：置于通風櫥，待乙醇徹底干后依次置于二甲苯(Ⅰ)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min，待載玻片上殘留二甲苯揮干后用中性樹膠封片。

1.3.6 Western blot檢測大鼠股骨骨折組織中LRP5、β-catenin、Runx2蛋白水平 將大鼠右側股骨骨折端骨組織在液氮中迅速研磨成粉末，取約200 g粉末加入1mL含PMSF的組織裂解液于冰上靜置2 h，采用BCA法測定蛋白濃度，處理好待測樣品后，取50μg蛋白進行SDS-PAGE電泳分離，轉膜，將分離的蛋白電轉移至PVDF膜上。封閉液室溫封閉1h，經LRP5、β-catenin、Runx2及GAPDH抗體(1∶1000)孵育后，4℃過夜。PBST充分洗膜后，加入二抗(1∶2000)室溫孵育1 h，PBST清洗后顯色液顯影，利用凝膠成像儀成像后，進行灰度值檢測。

2 結果

2.1 骨折前各組大鼠全身骨密度 與對照組相比，模型組及雞血藤低、中、高劑量組大鼠全身骨密度均顯著降低(P<0.05)，且模型組及雞血藤低、中、高劑量組間大鼠骨密度不存在顯著性差異(P>0.05)，提示骨質疏松大鼠模型建立成功，可以繼續進行后續實驗，見表1。

表1 骨折前各組大鼠全身骨密度Table 1 Whole body bone mineral density of rats in different groups before fracture

2.2 雞血藤對骨折大鼠內固定術治療后骨密度的影響 與對照組相比，模型組骨質疏松性骨折大鼠股骨骨折端骨密度顯著降低(P<0.05)，提示造模成功；與模型組相比，雞血藤低、中、高劑量組大鼠股骨骨折端骨密度顯著升高(P<0.05)，且隨著雞血藤劑量的增加，骨折大鼠股骨骨密度逐漸升高，提示雞血藤能夠呈劑量依賴性顯著增加骨質疏松性骨折大鼠內固定術治療后的骨密度，促進受損骨組織恢復，改善術后骨組織生理結構及功能，見表2。

表2 各組大鼠股骨骨密度Table 2 Bone mineral density of femur in different groups of rats

2.3 雞血藤對骨折大鼠內固定術治療后骨生物力學的影響 與對照組相比，模型組大鼠最大載荷和抗彎強度均顯著降低(P<0.05)，提示造模成功；與模型組相比，雞血藤低、中、高劑量組大鼠最大載荷和抗彎強度均顯著升高(P<0.05)，且隨著雞血藤劑量的增加，大鼠最大載荷和抗彎強度逐漸升高，提示雞血藤能夠呈劑量依賴性顯著改善骨質疏松性骨折大鼠內固定術治療后的生物力學指標，促進骨質疏松性骨折大鼠內固定術治療后骨組織生理結構及功能的恢復，加速新骨的形成，增強骨組織硬度，從而降低大鼠再次骨折風險，改善大鼠的疾病狀態及轉歸，見表3。

表3 各組大鼠最大載荷和抗彎強度Table 3 Maximum load and bending strength of rats in different groups

2.4 組織病理學檢查 與對照組相比，模型組大鼠骨痂骨小梁明顯減少，散在分布，排列不整齊，成骨細胞明顯減少，與模型組相比，雞血藤各劑量組大鼠骨痂骨小梁明顯增多，成骨細胞數量明顯增多，且雞血藤低、中劑量組大鼠骨小梁粗細均勻，排列緊密，部分連成網狀，可見新生微小血管，雞血藤高劑量組大鼠骨小梁增粗明顯，生長旺盛，排列致密整齊，可見大量成骨細胞及新生血管，提示雞血藤能夠顯著改善骨質疏松性骨折大鼠內固定術治療后骨痂的形成，促進骨組織的恢復及愈合，加快骨折大鼠新骨的形成，見圖1。

圖1 各組大鼠組織病理學檢查結果(HE100×)Figure 1 Histopathological examination of rats in different groups注：A.對照組；B.模型組；C.雞血藤低劑量組；D.雞血藤中劑量組；E.雞血藤高劑量組

2.5 雞血藤對骨折大鼠內固定術治療后股骨Wnt/β-catenin信號通路的影響 各組大鼠股骨骨折組織中LRP5、β-catenin、Runx2蛋白水平，見圖2。結果表明，與對照組相比，模型組大鼠骨折組織中LRP5、β-catenin、Runx2水平均顯著降低(P<0.05)，提示骨質疏松性骨折大鼠骨組織的恢復與Wnt/β-catenin信號通路密切相關；與模型組相比，雞血藤各劑量組大鼠骨折組織中LRP5、β-catenin、Runx2水平均顯著升高(P<0.05)，且LRP5、β-catenin、Runx2水平與雞血藤劑量表現出依賴性，提示雞血藤能夠顯著提高骨質疏松性骨折大鼠內固定術治療后骨折組織中LRP5、β-catenin、Runx2水平，激活Wnt/β-catenin信號通路，進而促進骨折大鼠骨組織修復。

圖2 各組大鼠股骨骨折組織中LRP5、β-catenin、Runx2蛋白水平Figure 2 Protein levels of LRP5,β-catenin and Runx2 in femoral fracture tissues of rats in different groups注：與對照組相比，①P<0.05；與模型組相比，②P<0.05

3 討論

骨質疏松癥是一種全身性、代謝性骨骼系統疾病，其病理特征為骨量降低、骨微細結構破壞、骨脆性增加，骨強度下降，易發生骨折。骨質疏松癥的發病機制與年齡、性別、種族等因素密切相關，其中絕經后婦女發生率較高[1-3]。骨折是骨質疏松癥最嚴重的后遺癥，目前臨床上對于骨質疏松性骨折的治療基本原則是復位、固定、功能鍛煉和抗骨質疏松[4]。

雞血藤來源于豆科植物密花豆的干燥藤莖，中國古典醫學著作記載雞血藤具有活血補血，調經止痛，舒筋活絡等作用。近年研究發現，雞血藤具有促進骨折愈合、抗類風濕性關節炎、改善心肌缺血、促進血管生成、改善小鼠脾臟輻射損傷等藥理作用[5-8]。雞血藤用于治療骨質疏松等相關疾病的中藥成方制劑廣泛記載于中醫古典醫學著作中，近年仲超[17]、宋松[18]等學者研究發現含有雞血藤的中藥方劑在骨質疏松的臨床治療中療效顯著。但雞血藤對骨質疏松性骨折大鼠內固定術后恢復的作用及機制目前尚罕見明確報道。

Wnt/β-catenin信號通路是細胞生長發育過程中重要的信號轉導通路。在發育過程許多不同的細胞和組織中，Wnt/β-catenin整合許多其他通路所傳遞的信號，并通過多種細胞因子引起一系列信號級聯反應，β-catenin既是一個完整的細胞-細胞粘附接頭蛋白也是一個轉錄調節輔因子，存在于多種條件依賴的活化和抑制復合體中，與細胞的生長發育和增殖密切相關，同時也與多種疾病密切相關[9-10]。研究表明Wnt/β-catenin信號通路與骨折的愈合密切相關，激活Wnt/β-catenin信號通路能夠促進骨折的愈合，使成骨細胞的數量增加，促進新骨的生成[11-13]。石曉征等[19]發現骨質疏松大鼠體內Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白水平顯著降低，梅花鹿茸Ⅰ型膠原能夠顯著改善大鼠骨密度，其機制可能與調節Wnt/β-catenin信號通路有關。趙素霞等[20]研究發現去卵巢引起的大鼠骨質疏松的發病機制與Wnt/β-catenin信號通路密切相關，通過調節大鼠Wnt/β-catenin信號通路的表達狀態能夠顯著改善大鼠骨質疏松癥狀。史巖等[21]也發現在骨質疏松性骨折大鼠疾病恢復過程中，Wnt/β-catenin信號通路扮演著重要角色，調節大鼠該通路相關蛋白的表達，能夠促進骨折大鼠的傷口愈合。由此可見，Wnt/β-catenin信號通路在骨質疏松及發病機制及疾病恢復過程中都至關重要，調節該信號通路的表達可能是骨質疏松治療過程中的關鍵。

本文研究結果表明：與模型組相比，雞血藤各劑量組大鼠股骨骨折端骨密度、最大載荷和抗彎強度均顯著升高，骨密度是反應骨量的常用指標，骨生物力學中最大載荷及抗彎強度能夠直接反應骨質疏松骨骼的骨折風險及骨生理結構及功能，這表明雞血藤能夠顯著提高骨質疏松性骨折大鼠內固定術治療后骨組織的生理結構的恢復，促進新骨形成，加速骨折的愈合，降低大鼠再次發生骨折的風險，改善大鼠的疾病轉歸及預后。組織病理學變化明顯改善，雞血藤各劑量組大鼠股骨骨折組織中LRP5、β-catenin、Runx2蛋白水平均顯著升高，提示雞血藤能夠顯著提高骨質疏松性骨折大鼠內固定術治療后骨折組織中LRP5、β-catenin、Runx2水平，激活Wnt/β-catenin信號通路，進而促進骨折大鼠骨組織修復。由于時間及資金限制，本文未能就雞血藤對Wnt/β-catenin信號通路上下游相關的其他蛋白進行考察，擬在今后的研究中對雞血藤對骨質疏松大鼠發病機制相關的其他信號轉導通路及其靶向調節作用進行深入探討。

4 結論

雞血藤能夠促進骨質疏松性骨折大鼠內固定術后骨密度、骨生物力學等的恢復，其作用機制可能與調節Wnt/β-catenin信號通路有關。