Rho激酶抑制劑對腦梗死模型大鼠抗炎作用及TLR4/TRIF通路的影響

郭春保 張毅 周文芳 王興

(三峽大學第三臨床醫學院·國藥葛洲壩中心醫院 1.神經內科；2.重癥醫學科；3.心血管內科，湖北 宜昌 443002)

腦梗死主要因腦組織區域出現供血不足、在缺血和缺氧條件下造成腦組織病變或壞死而形成的，其發病機制有很多種，主要的發病原因是動脈粥樣硬化[1-2]。腦梗死中最常見的類型為血栓形成性腦梗死，腦動脈主干和皮質支動脈粥樣硬化導致血管腔狹窄或閉塞是血栓形成性梗死的主要表現。腦梗死致殘率和病死率高，容易復發，是危害人類健康常見的疾病[3-4]。目前臨床對于腦梗死的治療可在一定程度上改善患者臨床癥狀，但多數患者預后不良，較易出現神經功能障礙等不良事件的發生。Rho激酶抑制劑可改善腦部供血狀態、降低血腦屏障和血脊髓屏障的通透性。還可以抑制細胞的死亡和減輕體外谷氨酸的神經興奮毒性。基于此背景，為改善腦梗死患者預后，促進神經功能恢復，將Rho激酶抑制劑應用于腦梗死模型大鼠的干預治療中，以并觀察大鼠神經功能和抗炎因子，明確Rho激酶抑制劑改善大鼠神經功能和抗炎作用，為臨床上腦梗死的治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：SPF級SD健康大鼠45只，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，鼠齡(3.6±0.5)個月，體重(222.8±10.6)g。所有大鼠均養殖在干凈籠子里，室溫(22.1±2.0)℃，相對濕度38%～42%，每天光照12h，喂飲純凈水，飼養時間一周。本文研究所做實驗均獲得我院倫理委員會批準。主要試劑：Rho激酶抑制劑(上海源葉生物科技有限公司，貨號：155558-32-0)；水合氯醛(上海士鋒生物科技有限公司，貨號：302-17-0)；大鼠抗小鼠TLR4抗體(上海恒斐生物科技有限公司，貨號：K003881P)；兔抗大鼠TRIF抗體(深圳市豪地華拓生物科技有限公司，貨號：253451)；兔抗大鼠TRAM抗體(武漢菲恩生物科技有限公司，貨號：FNab10225)。

1.2 方法

1.2.1 分組及建模 隨機選取45只大鼠中15只作為空白組，另外30只大鼠參照卞鑫等[5]研究實驗中采用線栓法建立腦梗死模型。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，然后將它以仰臥位的姿勢擺放，做頸正中切口后將右側頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈進行分離。頸外動脈結扎離斷后，用縫線將頸總動脈近端結扎，用動脈夾將遠端夾閉，在頸動脈分叉處做一個小切口，將尼龍線栓經切口插入并松開動脈夾，慢慢向前推進約18～20mm，遇到阻力后停止，把血管外的線栓剪斷，縫合切口建模成功。最終30只大鼠中27只模型建立成功，建模成功率為90%，將建模成功的27只大鼠隨機分為模型組14只、給藥組13只。

1.2.2 給藥 在建模成功后給藥組大鼠腹腔注射Rho激酶抑制劑(法舒地爾)15mg/kg，空白組和模型組腹腔注射等容量生理鹽水。

1.2.3 切片及染色 采用斷頭法處死大鼠，立即取大鼠腦組織，將提取的組織制作標本，使用40mL/L的多聚甲醛進行固定，常溫下使用15%的EDTA脫鈣，脫水后進行石蠟包埋，制作3μm的組織切片，之后行HE染色處理，使用光學顯微鏡觀察大鼠腦組織變化。

1.2.4 BDNF、NSE、GFAP、TNF-α、ICAM-1、IL-1β水平檢測 抽取3組大鼠尾部靜脈血3mL，以離心半徑5cm、轉速3000r/min離心處理10min，分離上層血清，-80℃保存待檢。BDNF、NSE、GFAP、TNF-α、ICAM-1、IL-1β水平采用酶聯免疫吸附試驗法檢測，將血清樣本置于室溫后，取出試劑盒，標記酶標板，制作標準品，以1∶2的稀釋液稀釋樣品；在反應孔上依次加入稀釋好的待測血清及標準品100μL/孔，放置37℃恒溫孵育箱中濕育2h；用專用洗滌液將反應板清洗3次后，加入抗體工作液(1∶100倍稀釋后)100μL/孔，置于37℃恒溫孵育箱中濕育45min；繼續清洗反應板4次后，在反應孔內加入TMB溶液100μL/孔，置于37℃恒溫孵育箱中濕育45min后在反應孔內加入終止液100μL/孔以終止反應，在450nm波長(參考波長570-630nm)測定吸光度，顏色反應深淺與BDNF、NSE、GFAP、TNF-α、ICAM-1、IL-1β水平成正比，經繪制標準曲線計算BDNF、NSE、GFAP、TNF-α、ICAM-1、IL-1β水平。

1.2.5 TLR4/TRIF通路蛋白檢測 采用實時熒光定量PCR法進行檢測，取100mg樣品加100μL Trizol,研磨后加900μLTrizol,手動搖晃15秒，在溫室中靜置5分鐘；再加入200μL氯仿，手動搖晃15秒，在溫室中靜置3分鐘；在4℃的環境下，將它12000轉離心15分鐘；取上清500μL，加入500μL異丙醇，手動搖晃15秒，在溫室中靜置15分鐘；再將它12000轉離心10分鐘，棄上清，加入200-300μL75%冰酒精；然后再7500轉離心5分鐘，5-10分鐘的通風櫥干燥，最后加入雙無水20μL，85℃水浴5分鐘。采用2-△△Ct方法計算出TLR4/TRIF通路蛋白中TLR4、TRIF、TRAM表達量，內參β-actin：上游引物5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′,下游引物5′-TAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′；TLR4：上游引物5′-TCCTCTCCTGCCTGAGACC-3′，下游引物5′-CATGCATTGGTAAGTAGTGTTGGA-3′；TRIF：上游引物5′-TGAGGAGGGTTTCTGGTAGC-3′，下游引物5′-GGATGCCCAGAAGAACTTGT-3′；TRAM：上游引物：5′-CTCGCCTGCTTTTGTGGT-3′，下游引物：5′-TCGTTGGTGTCATCTTCTGC-3′。

2 結果

2.1 病理組織學觀察 空白組大鼠紋狀體和皮層有清晰的層。模型組大鼠炎性細胞浸潤到病變部位，一些空洞的病變被界定的膠質瘢痕包圍，并在大腦同側(受傷)側變成囊性。給藥組大鼠在同側(損傷)腦皮質和紋狀體未見空洞和排列不規則的細胞，見圖1。

圖1 三組大鼠病理組織學觀察圖(HE×400)Figure 1 Histopathological observation of rats in three groups

2.2 Rho激酶抑制劑對大鼠神經功能的影響 模型組、給藥組大鼠NSE、GFAP水平高于空白組，BDNF水平低于空白組，具有統計學差異(P<0.05)；給藥組大鼠NSE、GFAP水平低于模型組，BDNF水平高于模型組，差異有統計學差異(P<0.05)，見表1。

表1 Rho激酶抑制劑對大鼠神經功能的影響Table 1 Effects of Rho kinase inhibitor on nerve function in rats

2.3 Rho激酶抑制劑對大鼠抗炎作用的影響 模型組、給藥組大鼠TNF-α、ICAM-1、IL-1β水平高于空白組，差異有統計學差異(P<0.05)；給藥組大鼠TNF-α、ICAM-1、IL-1β水平低于模型組，差異有統計學差異(P<0.05)，見表2。

表2 Rho激酶抑制劑對大鼠抗炎作用的影響Table 2 Effects of Rho kinase inhibitor on anti-inflammatory effect in rats

2.4 Rho激酶抑制劑對大鼠腦組織中TLR4/TRIF通路蛋白的影響 模型組、給藥組大鼠腦組織中TLR4、TRIF、TRAM蛋白表達量高于空白組，差異有統計學差異(P<0.05)；給藥組大鼠腦組織中TLR4、TRIF、TRAM蛋白表達量低于模型組，差異有統計學差異(P<0.05)，見表3。

表3 Rho激酶抑制劑對大鼠腦組織中TLR4/TRIF通路蛋白的影響Table 3 Effect of Rho kinase inhibitor on TLR4 / TRIF pathway protein in rat brain

3 討論

腦梗死屬于神經系統疾病之一，大多數都是由于腦部血液供應障礙造成的。腦組織中出現了缺血缺氧壞死和神經功能缺損，會引起一系列臨床癥狀和體征，比如偏癱、肢體麻木和失語等[5-6]。隨著生活水平的提升，腦梗死發病率逐年升高，嚴重影響了人們的生活質量和身心健康。受影響的大腦部位決定腦梗死的癥狀，當梗死位于原發性運動皮層時會引起對側偏癱[7-8]，還會引起身體對側虛弱和失去知覺，頭部體檢表現為對側眼球運動不足和瞳孔擴張異常等現象。

Rho激酶抑制劑對腦血管痙攣選擇性擴張，可以增加腦血流量、降低血管阻力和改善腦灌注，還能通過增加肌球蛋白輕鏈磷酸酶的活性促使血管平滑肌舒張，改善腦組織的供血和供養。Rho激酶抑制劑可抑制炎性細胞、腦神經元細胞凋亡和炎性因子分泌及釋放，減少腦組織出現炎癥反應和組織損傷[9-10]；可促進Ca2+濃度的恢復，保證腦組織中線粒體功能正常，促進乳酸氧化，從而保護腦組織；可促進還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸形成，對細胞骨架蛋白的消失具有抑制作用；可抑制血漿中ET-1的表達，增加腦循環血量，促進腦組織恢復[11-12]。本研究結果顯示，與模型組和空白組大鼠相比，Rho激酶抑制劑可顯著改善腦梗死大鼠神經功能，清除機體炎癥反應。

BDNF主要分布于大腦的所有皮層區以及部分皮層下和脊髓區，是中樞神經系統中的神經生長因子，與神經細胞死亡、神經元修復相關[13]。NSE存在于神經元細胞漿內，是一種特殊蛋白酶，由神經細胞分泌形成的，可作為鑒別診斷腦梗死的主要指標[14]。中樞神經系統重要的組成成分是星形膠質細胞，星形膠質細胞骨架組成重要成分是GFAP，其水平高低與神經系統損傷程度相關[15]。TNF-α、ICAM-1、IL-1β等因子與大腦缺血有關，可以作用于血腦屏障破壞、髓鞘脫失、膠質細胞凋亡和白細胞浸潤[16]。大腦在接受缺血性損傷刺激時會產炎性因子，它會誘導腦微血管內皮細胞表達多種粘附分子，比如單核細胞黏附蛋白、血管細胞黏附分子和細胞間黏附分子等[17]。臨床研究顯示[18-19]，TLR4/TRIF信號通路與多種腦血管疾病相關，其中TLR4組織分布十分廣泛，在許多組織細胞中進行表達，在腦組織中主要表達于小膠質細胞，主要分布在大腦血管內皮細胞、側腦室和軟腦膜。在中樞系統壞死凋亡的細胞會釋放出HSP60，TLR4的神經毒性化合物會誘導小膠質細胞合成。TLR4還可以識別表面活性劑A、纖維蛋白原肽、硫酸肝素片段、透明質烷低聚糖和防御素[20]。TRIF是TLR下游信號通路中的重要因子，可以抵抗炎癥和抑制細胞的凋亡，為機體提供內源性的保護作用。TRIF途徑主要通過接受內毒素等刺激因子的刺激激活IRF-3，其信號轉導通路為：TLR4→TRIF相關的接頭分子→TRIF→TRAF結合蛋白-1→IRF-3，之后經過作用于神經遞質，最終導致神經病變[21]。本研究結果顯示，Rho激酶抑制劑經作用于TLR4/TRIF信號通路，抑制腦梗死患者炎癥反應，改善神經遞質表達，最終起到改善腦梗死癥狀的目的。

4 結論

Rho激酶抑制劑可顯著改善腦梗死大鼠神經功能和抑制炎癥反應，其機制可能與TLR4/TRIF信號通路相關。