外源性硫化氫對蛛網膜下腔出血大鼠早期腦損傷的改善作用及相關機制

曾進 田密 成建 蒙迪 聶偉

(湖南中醫藥高等專科學校附屬第一醫院神經內科，湖南 株洲 412000)

蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是中風的一種亞型，具有極高的致死率和致殘率[1]。早期腦損傷(Early brain injury，EBI)被證明是SAH患者高致死率的主要原因[2]。SAH后腦組織產生的氧化應激、腦水腫、血腦屏障通透性改變以及神經元的凋亡發生等均為EBI的重要成因[3]。硫化氫(H2S)作為繼NO和CO之后公認的第三種氣體信號分子，其具有廣泛的生物學效應[4-6]。最近研究顯示，外源性硫化氫能顯著降低實驗性SAH大鼠的腦損傷，且對癲癇大鼠的神經元具有一定程度的保護作用，但對其作用機制的研究尚不完備[7-8]。硫氧還蛋白系統包括硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)、硫氧還蛋白還原酶及NADPH等，是一個有效的蛋白還原系統，在機體氧化還原調節、抗氧化防御以及細胞增殖和生存過程中均發揮重要的作用[9-10]。雖然已有研究顯示H2S能夠通過激活TRX系統發揮對損傷機體的保護作用，但在SAH誘導的EBI研究中尚未見報道[11]。基于此，我們推測H2S可能通過激活TRX系統改善SAH誘導的EBI。故本研究構建大鼠SAH模型并采用外源性H2S進行干預，探討H2S對EBI的改善作用及機制，加深對SAH誘導的EBI致病機理的認識，為臨床治療SAH提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 36只6-7周齡無特定病原體(SPF)級健康雄性SD大鼠，體重(260±20)g，購自南華大學實驗動物學部，動物許可證編號：SCXK(湘)2015-0002。H2S供體NaHS購自Sigma公司；SOD及MDA測定試劑盒、全蛋白提取試劑盒、BCA法蛋白定量測定試劑盒、DAB顯色試劑盒、原位末端轉移酶標記技術(TUNEL)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；超敏ECL化學發光試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所；兔抗人TRX1多克隆抗體、兔抗人TXNIP單克隆抗體、兔抗人Bcl-2多克隆抗體以及兔抗人cleaved-caspase3多克隆抗體均購自英國Abcam公司；兔抗人GAPDH單克隆抗體，購自美國CST公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司。光學顯微鏡購自日本Olympus公司；Tanon-4100全自動數碼凝膠成像儀購自上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及SAH模型制備 實驗開始前，實驗動物先在動物室適應性喂養1周，自由進食，環境濕度45%～60%，溫度(23±2)℃。1周后，將36只大鼠隨機分成3組，假手術組、模型組和H2S供體-NaHS治療組，每組12只，且經統計學分析，組間大鼠體重比較無顯著差異(P>0.05)。模型組及治療組大鼠采用改良血管內穿刺法制作SAH模型[12]：腹腔注射2%的戊巴比妥鈉(3 mL/kg)麻醉大鼠，后仰臥位將大鼠固定于手術臺上，頸部皮膚剪毛暴皮，常規消毒處理；采用手術刀于頸正中切開皮膚，依次分離右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內動脈(ICA)，并結扎ECA和ICA之間的吻合支。將ECA結扎并剪斷，拉直，使其與ICA成一條直線，后將直徑為0.126 mm頭部銳化后的單股尼龍線由ECA置入ICA直至顱內，遇阻時再往前3 mm刺破血管，造成SAH；約15 s后拔出尼龍線，結扎ECA殘端，恢復血流后縫合傷口。假手術組除不刺破血管外，其余步驟一致。造模2 h后治療組大鼠按100 μmol/kg劑量腹腔內注射2 mL NaHS溶液，而模型組和假手術組大鼠均腹腔內注射等量生理鹽水。

1.2.2 大鼠神經行為學評估及腦含水量檢測 每組隨機挑選6只大鼠，參照Garcia等[13]的神經行為學評估標準進行神經功能評估。總分18分，共包括6項：①觸須反應。②肢體的本體感覺。③攀爬運動能力。④前爪的伸展性。⑤四肢運動的對稱性。⑥自主運動能力。每項0-3分，得分越低說明神經功能損傷越嚴重。隨后將神經功能評估后的各組大鼠斷頸處死，取腦組織記錄濕重A，后在100℃烤箱中烘烤24 h后取出記錄干重B，腦含水量=(腦濕重A-腦干重B)/腦濕重A×100%。

1.2.3 HE染色觀察腦組織海馬區病理變化 造模24 h后，斷頭處死各組剩余大鼠并取腦組織，剝離海馬區，并分成兩等份。一部分保存于4%多聚甲醛固定48 h，另一部分-80℃凍存備用。取固定了48 h的海馬組織標本，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋制作病理切片(厚度3～5 μm)。將石蠟切片依次再經脫蠟、蘇木精染色、分化以及藍化后伊紅染色、洗滌脫水以及透明后封片。光鏡下觀察染色并采集圖片。

1.2.4 海馬組織內源性H2S及氧化應激指標SOD、MDA水平檢測 取各組大鼠凍存的海馬組織，用磷酸鹽緩沖液(pH6.8)制備組織勻漿，采用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，后根據各指標試劑盒說明依次進行操作，分光光度計下記錄各組各指標的讀數，最后根據各指標標準曲線分別計算出每組樣本的各指標的實際濃度。其中內源性H2S含量以nmol·g-1(protein)表示，SOD含量以U·mg-1(protein)表示，MDA含量以mmol·g-1(protein)表示。

1.2.5 TUNEL染色檢測海馬區細胞凋亡 將各組海馬組織石蠟切片依次進行TUNEL染色處理：烤片和脫蠟；水化；蛋白酶K工作液常溫孵育15～30 min；滴加50 μL TUNEL反應混合液于樣品上，在濕盒、暗室中37℃避光孵育60 min；用PBS沖洗3次；加入50 μL轉化劑-POD于樣品上，在濕盒中37℃避光孵育30 min；用PBS沖洗3次；加入100 μL DAB底物，于15～25℃孵育10 min；用PBS沖洗3次；蘇木素復染、脫水、透明、封片，光鏡下隨機選擇3個視野，觀察凋亡細胞并計算凋亡率，其中陽性染色的細胞核呈棕褐色。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達 取-80℃凍存的海馬組織，分別進行蛋白提取，后進行濃度檢測；取20 μg蛋白和4 μL 2×SDS上樣緩沖液混合均勻，100℃變性10 min；上樣，10% SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉至PVDF膜上；用5%脫脂牛奶封閉1 h；PBS洗膜；PBS洗膜后分別加入兔抗人一抗(TRX1，1∶1000；TXNIP，1∶1000；Bcl-2，1∶1000；cleaved-caspase3，1∶1000；GAPDH，1∶1500)在4℃下孵育過夜；PBS洗膜；加入HRP標記的羊抗兔二抗IgG(1∶5000)室溫孵育0.5 h；PBS洗膜；用ECL化學發光進行顯色。以GAPDH為內參蛋白，后采用Quantity One圖像處理軟件對各指標灰度值進行半定量分析。

2 結果

2.1 外源性H2S治療改善SAH大鼠神經功能及腦含水量 造模24 h后評估結果顯示，假手術組、模型組和NaHS治療組大鼠神經功能評分分別為(16.5±0.89)分、(7.83±1.24)分、(12.83±1.64)分，與假手術組比較，SAH模型組大鼠評分顯著降低(P<0.05)，而與SAH模型組比較，NaHS治療組大鼠評分顯著升高(P<0.05)，見圖1A。造模24 h后檢測結果顯示，假手術組、模型組和NaHS治療組大鼠腦含水量分別為(55.36±4.58)%、(82.38±3.97)%、(65.47±3.34)%，與假手術組比較，SAH模型組大鼠腦含水量顯著升高(P<0.05)，而與SAH模型組比較，NaHS治療組大鼠鼠腦含水量顯著降低(P<0.05)，見圖1B。

圖1 各組大鼠神經功能評分及腦含水量檢測Figure 1 Neurological function score and brain water content of rats in each group 注：A.神經功能評分;B.腦含水量檢測。1.假手術組;2.SAH模型組;3.NaHS治療組。與假手術組比較，①P<0.05;與SAH模型組比較，②P<0.05

2.2 外源性H2S治療改善SAH大鼠早期腦損傷 造模24 h后海馬組織HE染色顯示，假手術組大鼠腦海馬組織錐體細胞形態結構完整，輪廓清晰可見，排列整齊，細胞數目多，核仁明顯，胞質豐富；模型組大鼠腦海馬組織錐體細胞排列雜亂，基質疏松，細胞脫失明顯，部分細胞出現核固縮、溶解等現象；而NaHS治療組大鼠海馬組織病變得到緩解，僅少量錐體細胞變性、脫失或核固縮，錐體細胞排列較整齊，核仁較清晰，見圖2。

圖2 各組大鼠海馬組織HE染色(400×)Figure 2 HE staining of hippocampal tissue of rats in each group 注：A.假手術組;B.SAH模型組;C.NaHS治療組

2.3 外源性H2S治療增加SAH大鼠海馬組織內源性H2S水平、抑制氧化應激反應 分光光度計法測定結果顯示，與假手術組比較，SAH模型組大鼠海馬組織內源性H2S、SOD水平顯著降低，而MDA水平顯著升高(均P<0.05)；而與SAH模型組比較，NaHS治療組大鼠海馬組織內源性H2S、SOD水平顯著升高，而MDA水平顯著降低(均P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠海馬組織內源性H2S，氧化應激指標SOD、MDA水平檢測Table 1 The levels of endogenous H2S,SOD and MDA in hippocampus

2.4 外源性H2S治療抑制SAH大鼠海馬組織神經元凋亡 為進一步探究外源性H2S治療對SAH早期腦損傷大鼠的修復作用，我們采用TUNEL染色鑒定和比較各組凋亡神經元。TUNEL染色結果顯示，假手術組、模型組和NaHS治療組大鼠海馬組織神經元凋亡率分別為(11.35±1.26)%、(37.56±3.24)%、(22.91±2.64)%，與假手術組比較，SAH模型組大鼠海馬組織神經元凋亡率顯著升高(P<0.05)；而與SAH模型組比較，NaHS治療組大鼠海馬組織神經元凋亡率顯著降低(P<0.05)，見圖3。

圖3 TUNEL染色檢測各組大鼠海馬組織神經元凋亡Figure 3 The apoptosis of hippocampal neurons in each group of rats A.海馬組織TUNEL染色(400×);B.海馬組織神經元凋亡率比較。1.假手術組;2.SAH模型組;3.NaHS治療組。與假手術組比較，①P<0.05;②與SAH模型組比較，P<0.05

2.5 硫氧還蛋白系統參與外源性H2S對SAH大鼠早期腦損傷的修復 Western blot檢測結果顯示，與假手術組比較，SAH模型組大鼠海馬組織TRX1及Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05)，TXNIP和cleaved-caspase3蛋白表達水平顯著升高(均P<0.05)；而與SAH模型組比較，NaHS治療組大鼠海馬組織TRX1及Bcl-2蛋白表達水平顯著升高(均P<0.05)，TXNIP和cleaved-caspase3蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05)見圖4。

圖4 Western blot檢測各組大鼠海馬組織TRX1、TXNIP、Bcl-2及cleaved-caspase3蛋白水平Figure 4 Trx1,TXNIP,BCL 2 and cleared caspase 3 protein levels in hippocampus of rats in each group注：A.Western blot檢測各指標蛋白水平表達;B.各指標蛋白水平半定量分析。1.假手術組;2.SAH模型組;3.NaHS治療組。與假手術組比較，①P<0.05;與SAH模型組比較，②P<0.05

3 討論

早期腦損傷(EBI)指的是蛛網膜下腔出血(SAH)后72 h內所發生的整個腦組織的直接性損傷，涉及急性腦血管痙攣、神經血管炎癥、腦血管功能障礙、血腦屏障損壞、腦積水及神經元凋亡等[14]。近些年，研究者對EBI的關注程度逐漸上升，其病理生理過程日益清晰，多種藥物也被運用于臨床治療，但EBI患者的治療效果仍不容樂觀[15]，這提示EBI的治療還面臨著巨大挑戰。

硫化氫(H2S)作為一種新型的信號分子，在血管性、神經性、缺血再灌注等多種疾病中均發揮了重要的生理和病理作用[16]。本研究發現外源性H2S補給治療能顯著改善SAH大鼠EBI，主要體現在神經功能評分的提升、腦積水含量的降低、海馬組織病理學損傷的修復、氧化應激反應的削弱及神經元凋亡率的降低這外源性H2S補給療法在SAH治療上是可行的。Cui等[7]在實驗研究中發現，SAH發生能顯著抑制腦組織及血漿H2S的產生，而補給外源性H2S進行治療后，大鼠EBI癥狀(包括腦水腫、血腦屏障破壞、腦細胞凋亡、炎癥反應以及腦血管痙攣)得到顯著改善；且外源性H2S。氧化應激是一種病理狀態，導致過度積累的氧自由基及相關代謝產物對細胞本身所產生的多種毒性作用[17]。外源性H2S對于氧化應激性疾病的治療研究也十分廣泛，如Pan等[18]發現外源性H2S對于高鹽誘導的大鼠心肌氧化應激反應及心肌肥大均具有較好的抑制作用。Gao等[19]發現外源性H2S在疊氮化鈉誘導的PC12細胞氧化應激中扮演著極好的神經性保護作用。而本研究同樣發現外源性H2S同樣能降低SAH大鼠海馬組織的氧化應激進而發揮對EBI的保護作用。

硫氧還蛋白(TRX)系統對于維持細胞的還原性微環境意義重大。哺乳動物體內含有兩套TRX系統細胞質TRX1系統及線粒體TRX2系統，硫氧還蛋白互作蛋白(TXNIP)則是細胞TRX的內源性抑制劑[20]。細胞質TRX1對機體內氧化性蛋白具有還原性，但當其與TXNIP結合時抗氧化能力便會大大降低造成細胞因累積氧化應激反應而更易發生凋亡現象。Li等[21]研究發現，通過siRNA靶向抑制TRX1的表達能進一步促進大鼠腦缺血再灌注后的氧化應激損傷，提示TRX1可能受核轉錄因子Nrf2調控，進而影響硫氧還蛋白過氧化物酶的還原活性。而Liang等[22]的研究發現，與假手術組比較，TXNIP在SAH大鼠損傷腦組織中的表達異常偏高；而通過白藜蘆醇(TXNIP抑制劑)進行處理后顯著降低了TXNIP及線粒體相關促凋亡因子的水平，并降低了SAH的預后指標，如腦積水、血腦屏障通透性及神經功能缺陷，這提示TXNIP可作為SAH的治療靶點。而本研究結果顯示外源性H2S能顯著促進SAH大鼠海馬組織TRX1，抑制TXNIP的表達，提示外源性H2S對SAH后EBI的保護作用與TRX系統密切相關。

線粒體依賴性凋亡途徑在正常細胞遭受非生理性改變時會被激活細胞凋亡刺激促使凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2發生平衡失調，同時破壞線粒體膜致使細胞色素C(Cyt C)從線粒體內釋放到細胞質中，最終誘導下游的caspase3被激活[23]。本研究結果顯示，與假手術組比較，SAH大鼠海馬組織神經元凋亡率顯著提升，Bcl-2表達下降而cleaved-caspase3表達上升；而外源性H2S補給治療顯著降低了神經元凋亡率，且上調了Bcl-2和下調了cleaved-caspase3的表達在脊髓缺血再灌注損傷的研究中，Xie等[24]發現氧化應激是自噬神經元細胞凋亡的主要誘因，且通過外源性H2S治療能降低自噬神經元細胞的死亡，恢復損傷大鼠的神經和運動功能；這一效應被證明與AKT-mTOR通路的調控密切相關。在慢性腎病的相關研究中，Askari等[25]發現長期進行外源性H2S補給治療能通過改善腎臟中氧化劑/抗氧化劑的平衡，減少炎癥和細胞凋亡來預防慢性腎病。由此可見，在多種疾病損傷中，外源性H2S可通過調控凋亡信號通路發揮損傷作用。

4 結論與啟示

外源性硫化氫可改善SAH大鼠早期腦損傷，這可能與激活硫氧還蛋白系統，進而降低氧化應激反應、抑制海馬神經元凋亡有關。這一結果將為SAH的臨床治療提供新思路。