生皮散對大鼠感染性創面微循環的保護作用

陽梅 廖詩平 鄭焱江 植茂輝 何張裕

(1.四川大學華西醫院血液內科，四川 成都 610041；2.四川大學華西護理學院，四川 成都 610041；3.四川大學華西基礎醫學與法醫學院，四川 成都 610041 )

不同原因造成的皮膚損傷是外科領域常見的臨床挑戰，如何加快創面組織愈合，獲得理想的療效一直是臨床工作追求的目標。研究表明72.5%的慢性創面由感染導致，是阻礙創面正常修復的重要因素之一[1-3]。完全上皮化是創面臨床愈合的標志，而感染性創面由于處于病理性炎癥狀態，炎性細胞在局部過度積累，且炎性介質調節機制失調，加重組織損傷程度，導致創面上皮化進程緩慢[4-7]。在創面治療方面，西醫主要以外用抗生素或激素治療為主，但近年來細菌的耐藥情況日趨嚴重，并且病人對藥物敏感，導致療效不佳。中醫學對于創傷的修復具有豐富的經驗和獨特的治療方案，在長期的歷史發展中形成了獨具特色的理論體系。中醫普遍認為創面的形成是由于全身營養消耗明顯，氣血虧虛，不能營養肌膚，摩擦破傷感染，引起壞死潰爛[8-10]。因此，中醫創立了祛瘀生肌、偎膿長肉等重要理論與治法。在中醫臨床實踐中，藥物療效和安全性往往相悖，如朱紅膏治療慢性皮膚潰瘍，但因含汞元素，臨床安全期僅有6周。因此需要開發新的安全有效的中藥制劑治療感染性創面[11]。生皮散是改良的新型中成藥制劑，以兒茶、冰片、沒藥、乳香、三七等十味中藥配伍組成，配方中兒茶、沒藥、乳香、三七、血竭等均能祛腐生肌、活血；而冰片、枯礬、黃柏、滑石等能清熱解毒。有研究報道，生皮散對大鼠壓瘡具有較好的治療效果，可以顯著抑制壓瘡局部的炎癥反應，減少炎癥因子的釋放，縮短創面愈合時間[12]。為探討生皮散對感染性創面的治療效果和可能的作用機制，本研究通過構建大鼠感染性創面模型，觀察外敷生皮散后大鼠感染性創面的愈合情況，同時采用激光多普勒血流儀檢測創面微循環的變化情況，探討生皮散修復創面的作用機制，為其臨床用藥提供藥理學依據。

1 材料與方法

1.1 受試藥品 生皮散，組成：兒茶12 g、煅牡蠣25 g、冰片1.2 g、沒藥7.5 g、乳香7.5 g、枯礬6 g、三七6 g、黃柏7 g、血竭 50 g、滑石 15 g。制作方法：以上各藥共研細末，過100目篩，待用。以上中藥飲片均購置于四川省中藥飲片有限責任公司,批號：150523。用法用量：外敷，一次4 g生皮散原生藥材，一日2次；即臨床成人(均以60 kg體重計)日用劑量擬定為0.13 g(原生藥材)/kg/d。用時溶于蒸餾水成膏狀備用。七厘散：散劑，規格：3 g/瓶。用法用量：口服，一次1～1.5g，一日1～3次；外用，調敷患處。北京同仁堂出品，批號：20150716，實驗時用滅菌水制成膏狀備用。

1.2 試劑與儀器 水合氯醛：分析純，AR級，成都市科龍化工試劑廠，批號：20150619。實驗時用純凈水配制成濃度10%。激光多普勒血流儀(PeriFlux 5000系統)，瑞典帕瑞醫學。AX-70顯微鏡成像系統，OLYMPUS。

1.3 實驗動物 SD大鼠，健康一級，體重(250±20)g，雌雄各半，四川大學試驗動物中心提供，合格證號：SCXK(川)2009-09，清潔級。于恒溫清潔環境中進行適應性飼養，飲水進食不限，持續1周。

1.4 菌株 金黃色葡萄球菌，由四川大學華西基礎醫學與法醫學院微生物教研室提供。

1.5 方法

1.5.1 感染性創面模型制備 參照楊嘉駿等[13]制備大鼠感染性創面模型的方法。用剃毛器將大鼠背部區域毛發剃除，面積3 cm×3 cm。1 d后將以10%水合氯醛(0.3 mL/100g)腹腔注射對大鼠進行麻醉，并在脫毛區域用1.5 cm×1.5 cm的塑料框架蘸苦味酸標記造模面積，在無菌條件下切除標記處全層皮膚，深至筋膜，充分止血后在創面噴灑金黃色葡萄球菌的PBS液0.2 mL(1×109CFU/mL)。創面覆蓋透明薄膜敷貼并用無菌醫用紗布包裹固定，待清醒后單籠飼養。48 h后創面出現不同程度感染征象，如創面附有膿性分泌物，創緣皮色發紅，表示造模成功。

1.5.2 實驗分組及給藥 將符合條件的60只SD大鼠，隨機選取10只作為空白組(正常大鼠)，其余大鼠制備感染性創面模型。48 h后，將接種細菌的大鼠隨機分為模型組、陽性對照藥七厘散組(0.45 g/kg)、生皮散高、中、低劑量組(1.8 g/kg、0.9 g/kg、0.45 g/kg)。給藥組和陽性對照組按分組給藥，連續15 d。空白組用蒸餾水沖洗后不作處理。

1.5.3 觀察指標

1.5.3.1 創面愈合情況 分別在造模后第3、5、7、10、15 d用透明硫酸銅板紙貼在創面表面，用筆在紙上描記創面面積。

1.5.3.2 形態學檢測 給藥后15 d取各組大鼠創面與正常皮膚交界組織，進行固定、石蠟包埋、切面，常規HE染色。根據盲法原則，采用OLYMPUS公司AX-70顯微鏡成像系統進行觀察分析及照相。

1.5.3.3 創面微循環血流量的測定 使用激光多普勒血流儀分別測量大鼠創面微循環血流量，血流量指標包括：血流灌注量(PU)、血細胞聚集程度(CMBC)以及運動血細胞速率(Velocity)。大鼠麻醉后，在室溫(25℃)下適應環境30 min。激光多普勒血流儀預熱30 min，并校準。選用公司配置的接觸型探頭，分別于給藥前和給藥后15 d測量創面微循環的相關指標。并計算出血流量的變化率。變化率=(造模前血流量-給藥15 d后血流量)/給藥前血流量×100%；血流灌注量變化率(PU)=(造模前PU-給藥15d后PU)/造模前CMBC；血細胞聚集程度(CMBC)=(造模前CMBC-給藥15d后CMBC)/造模前CMBC；運動血細胞的速率(Velocity)=(造模前Velocity-給藥15d后Velocity)/造模前Velocity。

2 結果

2.1 生皮散對大鼠體表感染創面愈合的作用 在大鼠創面滴加金黃葡萄球菌48 h后，出現不同程度感染，創面附有膿性分泌物，滲液較多，創緣皮色發紅。每日新鮮配置不同濃度的生皮散等量涂于創面，于第3、5、7、10、15 d測量創面面積。與模型組相比，生皮散高劑量組大鼠的創面面積從第5d開始顯著減少(P<0.05)，一直持續到第15 d；七厘散組和生皮散中、低劑量組大鼠的創面面積從7 d開始顯著減少(P<0.05)，其中，中劑量組持續至15 d；低劑量組持續到第10 d。與七厘散組相比，生皮散高、中劑量組大鼠的創面面積無顯著性差別。說明生皮散有明顯促進感染性創面愈合的作用，其中，高、中劑量更好,見圖1、表1。

圖1 治療前后大鼠感染性創面改變Figure 1 Change of infectious wound before and after treatment注：①,②.模型組；③,④.七厘散組；⑤,⑥.生皮散低劑量組；⑦,⑧.生皮散中劑量組：⑨,⑩.生皮散高劑量組

表1 生皮散對大鼠感染性創面大鼠創面面積的影響Table 1 Effect of SPP on area of infectious wound in rat

2.2 生皮散對大鼠感染性創面的病理學改變 空白組上皮組織大部分生成，表皮細胞分化良好，接近正常上皮，其下為平行排列的膠原纖維及小血管；模型組新生表皮較空白組表皮肥厚，其下可見大量增生的膠原纖維及炎性細胞，部分出現壞死后鈣化；生皮散組鏡下顯示，中、低劑量組新生表皮均較空白組表皮肥厚，其下為增生的膠原纖維及少量炎細胞，高劑量組新生表皮和空白組接近，僅部分出現炎癥細胞，見圖2。

圖2 生皮散對大鼠感染性創面的病理學改變(200×)Figure 2 Pathological changes of SPP on infectious wound in rats 注：A.假手術組；B.模型組；C.七厘散組；D.生皮散低劑量組；E.生皮散中劑量組；F.生皮散高劑量組

2.3 生皮散對大鼠感染性創面微循環的保護作用 與空白組相比，模型組PU、CMBC以及Velocity變化率均明顯增高(P<0.01)，說明造模后，大鼠的創面組織微循環發生嚴重障礙。與模型組相比，七厘散組和生皮散低劑量組的CMBC和Velocity變化率，生皮散中劑量組的PU和CMBC變化率以及生皮散高劑量組的PU、CMBC、Velocity變化率均顯著降低(P<0.05)。與七厘散組相比，生皮散中劑量的PU，高劑量的PU和Velocity均顯著降低(P<0.05)。說明生皮散能改善大鼠感染創面的微循環，生皮散高劑量組效果更好,見表2、圖3。

表2 生皮散對大鼠感染性創面微循環變化率的影響Table 2 Effect of SPP on change rate of infectious wound microcirculation in rat

圖3 生皮散對大鼠感染性創面微循環變化率的影響Figure 3 Effect of SPP on change rate of infectious wound microcirculation in rat

3 討論

感染性創面是臨床多種疾病常見的并發癥，如下肢靜脈潰瘍和糖尿病足部潰瘍，壞疽性膿皮病以及外傷或放射性損傷合并感染等導致的創面等[14]。不同原因導致的感染性創面有不同的病理生理過程，但共同的結局是創面愈合緩慢或愈合后復發，顯著降低了患者的生活質量，是臨床治療的難點[15-16]。

現代病理學認為創傷愈合是再生肉芽組織的充填及上皮組織覆蓋而愈的過程[17]。研究發現生肌類中藥具有促進瘡瘍愈合的作用，該類中藥除了加強創面免疫細胞活性、促進細胞生長因子之外，還能夠顯著改善創面微循環，因此在創面愈合中療效顯著[18]。

微循環是血液循環中非常重要的組成部分，包括微動脈、毛細血管、微靜脈。血液微循環和淋巴微循環一起組成微循環功能單元，承擔血液與組織之間氧、營養必需物質和代謝產物的交換及能量、信息傳輸，承擔血流流通、分配、組織灌注和一系列反饋調節、內環境穩定機制[19-20]。因此，微循環不僅是整體循環系統的末梢部分，也是許多器官中獨立的功能單位，在保持人體正常生理功能，各種疾病發生、發展和藥物作用機制中占突出地位[21]。由于各種原因導致行動不便的病人，因長期久臥致使皮膚表面無法及時更新血流供給，加之醫院易形成交叉感染，導致感染創面形成。有研究證實隨著創傷形成時間的延長，創面細小血管內血流速度逐漸減慢，甚至會發生瘀滯栓塞[22]。創面微循環障礙，不但導致局部營養物質供應減少和代謝產物積聚，還會造成創面免疫細胞數量減少、功能下降，抗感染能力減弱[23]。所以，改善微循環對于創面治療是非常重要的環節。

生皮散的組成成分兒茶、沒藥、乳香、三七、血竭等均能祛腐生肌和活血，因此生皮散具有改善血液循環的作用。本研究發現生皮散的外敷使得創面局部的血液循環得以改善，創面血管擴張，新生毛細血管的數量增加，血流量增加，免疫細胞增加，促進淤血合增生的軟化組織被吸收，也為創傷組織提供愈合所需的條件和營養。生皮散中藥制劑其組分可以有效改善創面局部微循環狀況，調動皮膚修復功能，促進創面愈合。然而由于該中藥方劑中藥味成分較多，還需要深入研究探索各組分的作用特點，闡明復方制劑的作用機制，為臨床用藥奠定實驗基礎。

4 結論

本實驗采用切除全層皮膚，并在創面滴加金黃葡萄球菌的方法制備大鼠感染性創傷模型，造模48h后創面出現不同程度感染特征：創面附有膿性分泌物，滲液較多，創面邊緣皮色發紅。給予生皮散15d后，創傷面積顯著縮小，炎癥細胞減少，出現大量新生肉芽組織；創面組織微循環灌注量、血細胞的聚集程度以及運動學細胞的速率得到明顯改善。表明生皮散對感染性創面有良好的治療作用，具有開發應用價值。