銀杏二萜內酯葡胺注射液對局灶性腦缺血大鼠SIRT1/HIF-1α/VEGF信號通路及突觸可塑性的影響

王輝 宋爽 趙建傳

(中國人民解放軍聯勤保障部隊第966醫院 1.神經內科；2.內科，遼寧 丹東 118000)

腦血管疾病致死、致殘率高，預后差，給患者家庭及社會帶來嚴重負擔，且發病率呈上升趨勢，但目前有效治療手段仍較少[1-2]，銀杏二萜內酯葡胺注射液即銀杏二萜內酯葡胺注射液，是由本項目組研發的治療缺血性腦卒中的新型藥，具有活血通絡之功效，可有效治療腦卒中、中風等腦血管疾病，改善患者神經功能，但其具體作用機制有待深入探究[3-4]。早期改善缺血性腦血管疾病邊緣區血流是改善組織損傷及患者預后的關鍵，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種較強的促血管生成因子，缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)是在缺血狀態下對血管新生其核心調控作用的轉錄因子，沉默信息調節因子2相關酶1(silent information regulator 2 related enzyme 1，SIRT1)可參與缺血缺氧狀態下氧化應激反應、炎癥反應等，在缺血性腦疾病腦血管損傷過程中發揮重要作用[5-6]。腦卒中后腦神經功能恢復還依賴于健在神經元軸突發芽形成新的突觸聯結，即突觸可塑性[7]。因此本研究通過觀察銀杏二萜內酯葡胺注射液對局灶性腦缺血大鼠SIRT1/HIF-1α/VEGF信號通路及突觸可塑性的影響，以期揭示其對缺血性腦損傷的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 成年雄性健康6周齡SPF級SD大鼠，體重180 g-200 g，購自南京君科生物工程有限公司。實驗動物生產許可證號：SCXK(蘇)2018-0011，動物質量合格證號：0019012509。大鼠均于(23±2)℃溫度、(50±10)% 濕度，12 h/12 h光照/黑暗環境，自由飲水飲食條件下適應性飼養1周。本動物實驗均經本院動物倫理委員會批準。

1.2 藥物、試劑及儀器 銀杏二萜內酯葡胺注射液(銀杏二萜內酯葡胺注射液，規格：每支裝5mL，含銀杏二萜內酯25mg，批準文號：國藥準字Z20120024)購自江蘇康緣藥業股份有限公司；尼莫地平(規格：4 mg/瓶，批準文號：國藥準字H20060182)購自福建省閩東力捷迅藥業有限公司；MCAO線栓(型號：503356PK5Re)購自天津敏學科技有限公司；兔源anti-PSD-95(貨號：ab18258)、anti-SYN(貨號：ab32127)、anti-SIRT1(貨號：ab189494)、anti-HIF-1α(貨號：ab2185)、anti-VEGF(貨號：ab53465)、anti-β-actin抗體(貨號：ab179467)，二抗羊抗兔IgG(貨號：ab6721)均購自英國Abcam公司；MODEL550型酶標儀購自美國Bio-Rad公司等。

1.3 方法

1.3.1 局灶性腦缺血大鼠模型建立及分組 72只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、尼莫地平組、銀杏二萜內酯葡胺注射液低、中、高組，每組12只。模型組、尼莫地平組、銀杏二萜內酯葡胺注射液低、中、高組大鼠參照改良Zea Longa法[8]，采用10%水合氯醛(350 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，分離頸總動脈，在頸內、頸外動脈分叉處結扎，在頸外動脈距頸內動脈2 mm處剪一小口插入中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)線栓，插入頸內動脈約18 mm，制備右側大腦局灶性腦缺血大鼠模型。假手術組只分離頸總動脈及頸內、頸外動脈，不插入MCAO線栓。術后24 h尼莫地平組尾靜脈注射尼莫地平16.2 mg·kg-1，銀杏二萜內酯葡胺注射液低、中、高組分別尾靜脈注射銀杏二萜內酯葡胺注射液1.3 mg·kg-1、2.6 mg·kg-1、5.2 mg·kg-1[9]，假手術組與模型組給予等體積0.9%生理鹽水，每天1次，連續7 d。另術后均連續3 d腹腔注射2萬U慶大霉素防止感染，并采用保溫燈照射保證術后大鼠肛溫37℃左右。

1.3.2 神經功能缺損評分測定 參照Bederson評分標準[10]，采用雙盲法于術后4 h(治療前)、7 d(治療后)對大鼠進行神經功能缺損評分：輕提大鼠尾巴遠離桌面10 cm，輕推大鼠肩膀，直至前肢滑動數厘米，并選擇不同方向重復數次。正常大鼠2個前爪向桌面方向伸直，在不同方向抵抗力一致，而腦損傷大鼠偏癱側前肢屈曲。無神經功能缺損記為0分；前肢屈曲，提尾實驗陽性記為1分；側推抵抗力下降，伴前肢屈曲，無轉圈行為記為2分；伴自發性轉圈行為、自由運動時向偏癱側劃圈記為3分。

1.3.3 腦含水量及腦梗死率測定 治療結束后，腹腔麻醉處死大鼠，斷頭取腦，置于液氮中，沿冠狀切成 2 mm切片5片，置于1% TTC中避光孵育10 min，染色后正常腦組織呈紅色，梗死腦組織呈白死，拍照后采用Image J軟件分析腦梗死區域面積，梗死率=5片梗死區域總面積/5片腦片總面積×100%。斷頭取腦后稱取腦組織濕重(wet，W)，之后置于95℃恒溫干燥箱中烘干至恒重，稱取干重(dry，D)，腦含水量=(W-D)/W×100%。

1.3.4 腦組織PSD-95、SYN、SIRT1、HIF-1α、VEGF蛋白表達量檢測 采用免疫印跡(western blot，WB)法[11]檢測缺血側腦組織突觸重塑標志蛋白突觸后密度蛋白-95(postsynaptic density protein-95，PSD-95)、突觸素(synaptophysin，SYN)及SIRT1/HIF-1α/VEGF信號通路相關蛋白SIRT1、HIF-1α、VEGF表達量。采用蛋白抽提試劑盒提取腦組織總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，置于-80℃保存備用。取40SymbolmA@g蛋白樣品，進行SDS-PAGE電泳，PVDF膜轉膜，室溫封閉，添加一抗anti-PSD-95(稀釋比1∶500)、anti-SYN(稀釋比1∶20000)、anti-SIRT1(稀釋比1∶1000)、anti-HIF-1α(稀釋比1∶1000)、anti-VEGF(稀釋比1∶500)、anti-β-actin抗體(稀釋比1∶5000)4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜，二抗IgG(1∶10000)室溫孵育1.5 h，顯色，曝片，觀察并分析各蛋白灰度值。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能缺損評分比較 術后4 h，與假手術組比較，模型組、尼莫地平組、銀杏二萜內酯葡胺注射液低、中、高組大鼠神經功能缺損評分顯著增加(P<0.05)。術后7 d，與假手術組比較，模型組大鼠神經功能缺損評分顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，尼莫地平組、銀杏二萜內酯葡胺注射液低、中、高組大鼠神經功能缺損評分顯著降低(P<0.05)，其中銀杏二萜內酯葡胺注射液中、高組依次低于尼莫地平組(P<0.05)，見表1。

2.2 各組大鼠腦含水量及腦梗死率比較 與假手術組比較，模型組大鼠腦含水量、腦梗死率顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，尼莫地平組、銀杏二萜內酯葡胺注射液低、中、高組大鼠腦含水量、腦梗死率顯著降低(P<0.05)，其中銀杏二萜內酯葡胺注射液中、高組依次低于尼莫地平組(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠腦含水量及腦梗死率比較Table 2 Comparison of brain water content and cerebral infarction rate in each group

2.3 各組大鼠腦組織SIRT1、HIF-1α、VEGF 蛋白表達量比較 與假手術組比較，模型組大鼠腦組織SIRT1、HIF-1α、VEGF蛋白表達量顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，尼莫地平組、銀杏二萜內酯葡胺注射液低、中、高組大鼠腦組織SIRT1、HIF-1α、VEGF蛋白表達量顯著增加(P<0.05)，其中銀杏二萜內酯葡胺注射液中、高組高于尼莫地平組(P<0.05)。見圖1、表3。

表3 各組大鼠腦組織SIRT1、HIF-1α、VEGF蛋白表達量比較Table 3 Comparison of SIRT1,HIF-1α,VEGF protein expression in brain tissue of rats in each group

圖1 WB檢測腦組織SIRT1、HIF-1α、VEGF蛋白表達Figure 1 WB detection of SIRT1,HIF-1α,VEGF protein expression in brain tissue

2.4 各組大鼠腦組織PSD-95、SYN蛋白表達量比較 與假手術組比較，模型組大鼠腦組織PSD-95、SYN蛋白表達量顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，尼莫地平組、銀杏二萜內酯葡胺注射液低、中、高組大鼠腦組織PSD-95、SYN蛋白表達量顯著增加(P<0.05)，其中銀杏二萜內酯葡胺注射液中、高組高于尼莫地平組。見圖2、表4。

圖2 WB檢測大鼠腦組織PSD-95、SYN蛋白表達Figure 2 Detection of PSD-95 and SYN protein expression in rat brain by WB注：A.假手術組；B.模型組；C.尼莫地平組；D.銀杏二萜內酯葡胺注射液低組；E.銀杏二萜內酯葡胺注射液中組；F.銀杏二萜內酯葡胺注射液高組

表4 各組大鼠腦組織PSD-95、SYN蛋白表達量比較Table 4 Comparison of PSD-95 and syn protein expression in brain tissue of rats in each group

3 討論

缺血性腦卒中是由于腦血管阻塞、血流減少導致氧氣及其他營養物質缺乏引起腦組織應激反應、炎性損傷等，可導致神經毒性反應和細胞死亡，最終導致神經功能障礙[12-13]。本研究采用MCAO線栓法[14]制備局灶性腦缺血大鼠模型，結果發現，術后4 h即可出現神經功能缺損，提示局灶性腦缺血可導致大鼠神經功能障礙，即模型制備成功。銀杏二萜內酯葡胺注射液是治療缺血性腦疾病的第5類新藥，主要由銀杏二萜內酯A(約占60%)、銀杏二萜內酯B(約占2%)、銀杏二萜內酯K(約占26%)組成，研究表明，銀杏二萜內酯葡胺注射液可有效抑制缺血再灌注大鼠腦細胞凋亡，改善腦脊液生化水平，調節腦內氨基酸類和單胺類神經遞質水平等，對腦損傷有顯著保護作用[15-17]。本研究結果發現，大鼠給予尼莫地平或銀杏二萜內酯葡胺注射液治療后，與模型組比較，尼莫地平組、銀杏二萜內酯葡胺注射液低、中、高組大鼠神經功能缺損評分、腦含水量、腦梗死率顯著降低，其中銀杏二萜內酯葡胺注射液中、高組低于尼莫地平組，提示銀杏二萜內酯葡胺注射液可顯著減輕局灶性缺血性引起的大鼠腦組織水腫及腦梗死，改善其神經功能。

SIRT1是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)依賴的脫乙酰基酶，可靶向多種轉錄因子及信號分子，參與多種細胞增殖、凋亡、能量代謝、氧化應激等過程的調控[18]。SIRT1還可參與血管內皮穩定及內皮重塑，是血管生成反應中重要調節因子[19]。馬毓等[20]研究報道，缺血腦組織SIRT1過表達及活性增高可減少腦梗死面積，促進腦組織VEGF表達及神經血管新生，降低神經功能缺損評分。血管新生可增加腦梗死局部血流及氧供應，HIF-1α可調節缺血缺氧時細胞內氧平衡，作為轉錄因子激活下游靶基因VEGF等表達，促進新血管生成，改善腦缺血后能量代謝障礙[21]。Geng等[22]研究報道，促進HIF-1α/VEGF信號通路激活可增強HUVECs細胞的缺氧耐受性和血管穩態，改善小鼠皮瓣缺血再灌注損傷。本研究結果發現，與假手術組比較，模型組大鼠腦組織SIRT1、HIF-1α、VEGF蛋白表達量顯著降低；與模型組比較，尼莫地平組、銀杏二萜內酯葡胺注射液低、中、高組大鼠腦組織SIRT1、HIF-1α、VEGF蛋白表達量顯著增加，提示銀杏二萜內酯葡胺注射液可改善局灶性腦缺血大鼠神經功能及腦梗死可能與增加腦組織SIRT1、HIF-1α、VEGF蛋白表達，促進SIRT1/HIF-1α/VEGF信號通路激活有關。

局灶性腦缺血后腦組織梗死損傷，突觸后膜N-甲基-D-門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體激活，鈣離子通透性增加，可引起興奮性氨基酸毒性損傷，造成機體神經功能障礙，而突觸結構的可塑性與神經生長、修復等密切相關[23]。SYN是特異性位于軸突終末的突觸囊泡膜面上的鈣結合蛋白，其表達量可間接反映突觸密度，與神經可塑性密切相關。PSD-95是PSD蛋白家族之一，是附著于突觸后膜胞質側的一種超微結構，是神經信息傳遞的重要基礎，是突觸功能活動變化的標志性蛋白[24,25]。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠腦組織PSD-95、SYN蛋白表達量顯著降低，與模型組比較，尼莫地平組、銀杏二萜內酯葡胺注射液低、中、高組大鼠腦組織PSD-95、SYN蛋白表達量顯著增加，提示銀杏二萜內酯葡胺注射液可改善局灶性腦缺血大鼠神經功能可能與上調腦組織PSD-95、SYN蛋白表達，促進突觸可塑性有關。

4 結論

銀杏二萜內酯葡胺注射液可對抗局灶性腦缺血，改善大鼠神經功能，可能與促進SIRT1/HIF-1α/VEGF信號通路激活及腦缺血后突觸可塑性形成有關，可對銀杏二萜內酯葡胺注射液治療缺血性腦疾病的作用機制研究提供新的參考。