芍藥苷對幼鼠癲癇持續狀態后海馬神經元的保護作用

鄭婷婷 趙聰選 張莉

(1.大連市兒童醫院神經內科，遼寧 大連116000；2.遼寧中醫藥大學附屬醫院超聲心電中心，遼寧 沈陽110032)

癲癇是以大腦神經元突發異常放電導致大腦功能出現短暫障礙的一種神經系統疾病，可導致大腦皮質、海馬體等區域神經元損傷，也是兒童最常見的神經系統疾病之一[1-2]。研究表明，約75%的癲癇患者于兒童時期起病，口服抗癲癇藥物是主要治療方法[3]。盡管癲癇的診斷和治療研究不斷進步，但抗癲癇藥物的長期使用可導致諸多不良反應，且仍有30%左右的兒童患者療效不佳，嚴重者發展為難治性癲癇，對患者的身心健康造成嚴重影響[4]。因此，探究癲癇的發病機制，尋找新的癲癇治療藥物及靶點具有重要的臨床意義。芍藥苷是是白芍、赤芍和牡丹的主要有效成分，屬于水溶性單萜類糖苷，據報道，芍藥苷具有鎮痛、抗炎、抗腫瘤、保護神經和調節免疫的作用，已廣泛用于神經系統疾病的研究和治療中，能夠通過多種作用機制減輕神經元細胞損傷，抑制神經細胞凋亡[5-7]。癲癇發病后往往造成神經元的損傷，我們猜想是否芍藥苷對癲癇發病造成的神經元損傷具有保護作用。本研究采用腹腔注射氯化鋰-匹魯卡品誘發癲癇持續狀態(status epilepticus，SE)，觀察芍藥苷對幼鼠癲癇持續狀態后海馬神經元的保護作用，探究其作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性Wistar幼年鼠72只，3周齡，體重(100±10)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2017-0011。飼養條件：室溫(22±2)℃，濕度(50±10)%，每天定時換氣，保持12 h：12 h光暗照明，食水不限。研究方案獲本院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器 芍藥苷(純度≥98%，美國Sigma-Aldrich)；氯化鋰、匹羅卡品(美國Sigma-Aldrich)；地西泮注射液(天津金耀藥業有限公司)；HE染色試劑盒、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；Nissl染色液(上海碧云天生物技術有限公司)；兔IgG-免疫組化試劑盒SABC即用型(博士德生物工程有限公司)；引物(日本Takara)；RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit，SYBR Green Real-Time PCR Master Mixes(美國Thermo Scientific)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力、丙二醛(malondialdehyde，MDA)ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)；B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2-associated X protein gene，Bax)、線粒體動力學相關蛋白(dynamin-related protein 1，DRP1)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)兔源單克隆抗體，羊抗兔二抗(美國CST公司)；平衡型核苷轉運載體-1(equilibrative nucleoside transporter-1，ENT1)蛋白兔源單克隆抗體(美國abcam公司)；雙板垂直電泳儀(北京六一儀器廠，型號：DYCZ-24KS)；顯微鏡(日本奧林巴斯，型號：IX53)；多功能凝膠成像系統(Syngene，型號：G:BOX)；酶標儀(Thermo Fisher Scientific，型號：Multiskan MK3)；高速冷凍離心機(長沙湘智離心機儀器有限公司，型號：TGL16MB)。

1.3 方法

1.3.1 分組、造模與給藥 3周齡SPF級Wistar大鼠72只，隨機分為對照組、模型組、芍藥苷組(50 mg/kg，i.p.)。除對照組外，其余各組幼鼠腹腔注射氯化鋰-匹魯卡品誘發SE，造模方法參考文獻[8]：大鼠稱重后腹腔注射127 mg/kg氯化鋰，20 h后腹腔注射1 mg/kg硫酸阿托品以降低匹羅卡品的外周膽堿能反應，30 min后腹腔注射50 mg/kg匹羅卡品。對照組大鼠僅腹腔注射等量生理鹽水。造模后2 h，芍藥苷組大鼠腹腔注射芍藥苷(50 mg/kg/d)，對照組和模型組同時腹腔注射等量生理鹽水。造模后密切觀察大鼠行為學變化，按照Racine評分標準[9]分為6級：0級為造模后無任何反應；Ⅰ級為大鼠面部抽搐、口角咀嚼、胡須抖動；Ⅱ級為大鼠面部抽動陣攣，不自主點頭；Ⅲ級為大鼠單側肢體陣發性抽搐；Ⅳ級為大鼠雙側前肢抽搐，并出現站立現象；Ⅴ級為在Ⅳ級的基礎上大鼠出現站立不穩和跌倒。達到 4級或以上的大鼠視為造模成功，癲癇發作30 min后腹腔注射10 mg/kg地西泮終止SE。

1.3.2 組織處理 造模1 d、3 d、7 d后，各組大鼠腹腔注射5%水合氯醛溶液進行麻醉。每組取4只大鼠快速斷頭取腦，將腦組織存放于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于ELISA試劑盒、Western blot和qRT-PCR檢測。剩余大鼠固定于手術臺，開胸，暴露心臟，剪開右心耳，灌注150 mL生理鹽水沖去血液，然后灌注150 mL 4%多聚甲醛固定，先慢后快，內固定完畢后斷頭取腦，置于4%多聚甲醛溶液中繼續固定48 h，用于Nissl染色。

1.3.3 Nissl染色觀察海馬組織病理學改變 腦組織4%多聚甲醛固定，冠狀切取含海馬的視交叉前后3 mm 腦組織，常規脫水、透明，石蠟包埋，預冷切片(厚度為4 μm)，二甲苯脫蠟，梯度乙醇復水，Nissl染色液染色3～10 min，蒸餾水洗滌2次，每次15 s，95%乙醇脫水5 min，二甲苯透明5 min，滴加中性樹膠封片，置于顯微鏡高倍鏡下觀察，計數每個高倍鏡視野下Nissl陽性染色細胞數量，取平均值。

1.3.4 ELISA法檢測海馬組織SOD活力和MDA含量 取造模第7天獲取的大鼠海馬組織，加入預冷PBS緩沖液，冰上研磨成勻漿，10 000 r·min-1離心10 min取上清，離心半徑為12.5 cm，分裝在EP管中，-80 ℃保存。①SOD活性檢測：取待測樣品20 μL，依次加入SOD檢測緩沖液、WST-8工作液和反應啟動工作液，37 ℃孵育30 min，450 nm波長測定吸光度(A)值，計算抑制百分率，抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定) /ΔA空白×100%，按照標準曲線計算待測樣品的SOD酶活力(U/mg)。②MDA含量檢測：取待測樣品100 μL，依次加入工作液、蒸餾水和待測樣品，置于100 ℃水浴中孵育60 min，冰浴冷卻，10 000 g常溫離心10 min，吸取200 μL上清液加入玻璃比色皿中，測定各樣品在450 nm、532 nm和600 nm處的吸光度A值，計算ΔA450=A450測定-A450空白，ΔA532=A532測定-A532空白，ΔA600=A600測定-A600空白，MDA含量(nmol/g)=5×[12.9×(ΔA532-ΔA600)-2.58×ΔA450]。

1.3.5 Western Blot檢測海馬組織Bcl-2、Bax、DRP1和ENT1蛋白表達 取造模第7天獲取的大鼠海馬組織，冰上研磨，離心取沉淀，加入裂解液提取組織蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，配置15%的分離膠和5%的濃縮膠進行SDS-PAGE電泳，上樣后80 V電泳2 h，60 V轉膜2 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，隨后將條帶放入10 mL Bcl-2、Bax、DRP1、ENT1兔源一抗稀釋液中，稀釋比例均為1∶1000，4℃過夜，第2天用TBST清洗后加入羊抗兔二抗(1∶2000)37℃孵育2 h，洗膜，滴加發光液，置凝膠成像系統顯影。免疫印跡實驗的內參蛋白為GAPDH，Image J軟件分析各個蛋白對應的灰度值，計算蛋白的相對表達量，蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

1.3.6 qRT-PCR法檢測海馬Bcl-2、Bax、DRP1和ENT1 mRNA表達 取造模第7天獲取的大鼠海馬組織，冰上研磨，加1 mL Trizol裂解液提取組織總RNA，使用RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒合成cDNA，作為熒光定量模版。引物由日本Takara 公司設計合成，所有樣品均以GAPDH為內參。反應體系：dNTPs 0.5 μL+5×Buffer 5 μL+Taq 酶0.3 μL+MgCl21.5 μL+cDNA 模板2 μL+上下游引物分別1 μL，加去離子水至總體積25 μL。反應條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s、62 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，重復40個循環，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃ 5 min終止反應，實驗重復3次。采用2-△△CT的方法計算目的基因mRNA相對表達水平的變化。引物序列，見表1。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences

2 結果

2.1 造模后大鼠行為學變化 造模后5 min，大鼠出現面部抽搐、口角咀嚼、流涎、腹瀉等外周反應。造模后10 min，大鼠面部抽動陣攣，不自主眨眼、點頭、胡須抖動。造模后30 min以上，大鼠呈雙側前肢抽搐和站立現象，甚至出現站立不穩和跌倒，表明造模成功。

2.2 芍藥苷對海馬組織病理變化的影響 Nissl染色顯示，對照組大鼠海馬CA3區神經元呈多層分布，錐體細胞及顆粒細胞形態正常，染色均勻，排列緊密，胞體呈圓形或橢圓形，核仁明顯，胞漿內尼氏小體豐富，偶見細胞核固縮。與正常組比較，模型組大鼠海馬CA3區神經元數量減少、變形，排列紊亂，胞體縮小或破裂，細胞核固縮，胞漿內尼氏小體顯著減少。與模型組比較，芍藥苷組大鼠海馬CA3區神經元受損程度減輕。見圖1。對照組、模型組、芍藥苷組Nissl陽性染色細胞數量分別進行組間比較，差異有統計學意義(F1d=89.36，P1d<0.01；F3d=68.65，P3d<0.01；F7d=72.38，P7d<0.01)。進一步兩兩比較結果顯示，第1天、第3天和第7天時模型組(t1d=44.25，P1d<0.01；t3d=38.91，P3d<0.01；t7d=52.17，P7d<0.01)和芍藥苷組(t1d=25.73，P1d<0.05；t3d=36.84，P3d<0.01；t7d=42.28，P7d<0.05)Nissl陽性染色細胞數量均顯著高于對照組，芍藥苷組Nissl陽性染色細胞數量均低于模型組(t1d=47.69，P1d<0.01；t3d=37.19，P3d<0.01；t7d=26.58，P7d<0.05)，差異有統計學意義。其中，對照組在第1天、第3天、第7天時Nissl陽性染色細胞數量進行組間比較，差異無統計學意義(F=1.02，P>0.05)，模型組和芍藥苷組在第1天、第3天、第7天時Nissl陽性染色細胞數量分別進行組間比較，差異有統計學意義(F模型組=18.36，P<0.05；F芍藥苷組=11.14，P<0.05)。進一步兩兩比較顯示，模型組在第3天和第7天時Nissl陽性染色細胞數量均高于第1天(t3d=24.21，P3d<0.05；t7d=21.54，P7d<0.05)，第7天時Nissl陽性染色細胞數量高于第3天(t7d=34.06，P7d<0.01)。芍藥苷組第3天和第7天時Nissl陽性染色細胞數量低于第1天(t3d=19.36，P3d<0.05；t7d=33.27，P7d<0.01)，第3天和第7天時Nissl陽性染色細胞數量比較差異無統計學意義(t3d=1.33，P3d>0.05；t7d=0.94，P7d>0.05)。見表2。

圖1 Nissl染色觀察大鼠海馬組織病理變化(400×)Figure 1 Nissl staining was used to observe the pathological changes of rat hippocampus注：A.對照組；B.模型組；C.芍藥苷組

表2 各組大鼠在不同時間點時Nissl染色陽性細胞數量比較Table 2 Comparison of Nissl staining positive cells in each group at different time

2.3 ELISA法檢測芍藥苷對海馬組織氧化應激的影響 對照組、模型組、芍藥苷組大鼠海馬組織SOD活力、MDA含量分別進行組間比較，差異均有統計學意義(F=36.25、41.28、31.20，均P<0.01)，進一步兩兩比較顯示，模型組和芍藥苷組SOD活力低于對照組(t模型組=25.66，P<0.05；t芍藥苷組=39.24，P<0.01)，MDA含量高于對照組(t模型組=31.32，P<0.01；t芍藥苷組=48.96，P<0.01)。與模型組比較，芍藥苷組SOD活力升高(t芍藥苷組=26.47，P<0.05)，MDA含量降低(t芍藥苷組=42.58，P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠海馬組織SOD活力和MDA含量比較Table 3 Comparison of SOD activity and MDA content in hippocampus of rats in each group

2.4 Western Blot檢測芍藥苷對海馬組織Bcl-2、Bax、DRP1、ENT1蛋白表達的影響 結果顯示，對照組、模型組、芍藥苷組Bcl-2、Bax、DRP1、ENT1蛋白表達水平分別進行組間比較，差異有統計學意義(F=25.98、33.87、63.21、49.82，均P<0.01)。進一步兩兩比較顯示，模型組(tbax=20.51，P<0.05；tDRP1=33.19，P<0.01；tENT1=26.32，P<0.05)和芍藥苷組(tbax=19.34，tDRP1=27.63，tENT1=19.77，均P<0.05)海馬組織Bax、DRP1和ENT1表達顯著高于對照組，模型組(tbcl-2=37.36，P<0.01)和芍藥苷組(tbcl-2=29.57，P<0.05)Bcl-2表達顯著低于對照組。與模型組比較，芍藥苷組Bax、DRP1和ENT1表達降低(tbax=61.25，tDRP1=58.17，tENT1=36.49，均P<0.01)，Bcl-2表達增加(tbcl-2=59.01，P<0.01)。見圖2，表4。

表4 各組大鼠海馬組織Bcl-2、Bax、DRP1、ENT1蛋白表達比較Table 4 Comparison of protein expression of Bcl-2,Bax,drp1 and ENT1 in hippocampus of rats in each group

圖2 Western Blot檢測大鼠海馬組織Bcl-2、Bax、DRP1、ENT1蛋白表達Figure 2 Western blot was used to detect the protein expression of Bcl-2,Bax,DRP1 and ENT1 in hippocampus of rats

2.5 qRT-PCR檢測芍藥苷對海馬組織Bcl-2、Bax、DRP1、ENT1 mRNA的影響 結果顯示，對照組、模型組、芍藥苷組3組間Bcl-2、Bax、DRP1、ENT1 mRNA表達水平比較，差異有統計學意義(FBcl-2=26.14，P<0.05；FBax=49.78，P<0.01；FDRP1=24.76，P<0.05；FENT1=32.33，P<0.01)。進一步兩兩比較顯示，模型組(tbax=44.36，P<0.01；tDRP1=46.37，P<0.01；tENT1=25.03，P<0.05)和芍藥苷組(tbax=43.45，tDRP1=52.24，tENT1=31.55，均P<0.01)海馬組織Bax、DRP1和ENT1 mRNA表達顯著高于對照組，模型組(tbcl-2=29.31，P<0.05)和芍藥苷組(tbcl-2=48.05，P<0.01)Bcl-2 mRNA表達顯著低于對照組。與模型組比較，芍藥苷組Bax、DRP1和ENT1 mRNA表達降低(tbax=24.54，tDRP1=26.83，tENT1=19.06，均P<0.05)，Bcl-2 mRNA表達增加(tbcl-2=28.65，P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠海馬組織Bcl-2、Bax、DRP1、ENT1 mRNA表達比較Table 5 Comparison of Bcl-2,Bax,DRP1 and ENT1 mRNA expression in hippocampus of rats in each group

3 討論

癲癇是神經系統的常見發作性疾病，具有重復性、短暫性和發作性等特點，也是幼兒神經系統疾病中致死率和致殘率極高的急重癥，嚴重影響患者的生活質量[10-11]。癲癇發作時神經元異常放電和興奮，這種活動與能量代謝密切相關，而線粒體在能量代謝和轉換過程中起關鍵作用[12-13]。研究表明，長期反復的癲癇發作可導致線粒體功能受損，使參與調控線粒體分裂過程的關鍵蛋白——DRP1異常高表達，引發細胞凋亡和神經元損傷[14]。ENT1是一種轉運核苷及其類似物的膜整合蛋白，該蛋白在哺乳動物組織中廣泛存在，在控制神經系統細胞外腺苷的水平中發揮主導作用，參與調節神經元的活動[15]。研究表明，癲癇發作時，ENT1可通過抑制腺苷受體提高胞外谷氨酸水平，谷氨酸是人體內主要的興奮性氨基酸，而興奮性氨基酸的水平過高可導致癲癇的發作[16]。Luo等[17]的研究表明，DRP1的表達異常可影響線粒體動力學失衡，影響ENT1功能變化，增加谷氨酸等興奮性氨基酸的釋放增加，是導致癲癇的機制之一。在本研究中，我們以DRP1-ENT1軸為切入點，觀察芍藥苷對癲癇幼鼠神經元的保護作用，初步探究其作用機制。

在本研究中，我們通過腹腔注射氯化鋰-匹魯卡品誘發SE，模型組、芍藥苷組大鼠均出現癲癇發作，Racine評分為4級以上，表明造模成功。研究表明，癲癇發作可造成腦神經細胞數量減少、神經元損傷和細胞凋亡，可直接影響患兒的病情發展和預后情況[18]。本研究通過Nissl染色觀察芍藥苷對癲癇大鼠海馬損傷的保護作用。病理切片染色顯示，模型組癲癇大鼠海馬區神經元受損明顯，排列紊亂，胞體縮小或破裂，細胞核固縮，胞漿內尼氏小體減少，隨著時間的推移，損傷細胞數量增加。與模型組比較，芍藥苷組大鼠海馬CA3區受損神經元數量減少，受損程度減輕，損傷細胞數量隨著時間的推移未增加，表明芍藥苷對癲癇造成的大鼠海馬神經元損傷具有抑制作用。研究表明，癲癇等神經系統疾病可誘發大腦細胞氧化應激損傷，同時削弱其抗氧化能力，是癲癇發生及持續發作的重要機制之一，其中，SOD是一種重要的抗氧化酶，SOD的水平可反映機體清除自由基的能力；MDA則與組織細胞受損程度相關，是氧自由基損傷組織細胞后產生的脂質過氧化物[19-20]。夏順剛等[21]研究表明，調節患者機體氧化應激狀態可有效減少癲癇發作。本研究結果顯示，癲癇可增加海馬組織MDA含量，降低SOD活力，而芍藥苷可抑制癲癇誘發的氧化應激損傷，增加SOD活力，減少MDA產生。Bcl-2和Bax是調控細胞凋亡的關鍵基因，Bax過表達可促進細胞凋亡，而Bcl-2可與Bax形成二聚體，抑制Bax基因的表達，從而抑制細胞凋亡[22-23]。研究表明，增加Bcl-2和降低Bax的表達水平可減少海馬神經元的凋亡，產生對海馬神經元的保護作用和抑制癲癇的作用[24]。在本研究中，我們檢測了第7天時各組大鼠海馬組織中Bcl-2和Bax的表達情況，以此檢驗芍藥苷對癲癇發作誘導的細胞凋亡的影響。結果顯示，模型組大鼠海馬組織Bcl-2蛋白和mRNA表達水平顯著低于對照組，Bax蛋白和mRNA表達水平顯著高于對照組，使用芍藥苷對大鼠進行干預后可顯著減少Bax的表達水平，增加Bcl-2的表達水平，表明芍藥苷可顯著改善癲癇發作導致的細胞凋亡。研究表明，癲癇發作與線粒體功能密切相關，DRP1是調控線粒體活動的關鍵蛋白，可通過影響ENT1的表達參與癲癇的發生，而抑制EMT1的功能可降低海馬神經元的動作電位頻率，對癲癇發作后神經元損傷產生保護作用[25-26]。本研究檢測了癲癇發作后第7天時各組大鼠海馬組織DRP1和ENT1的蛋白和mRNA的表達水平，結果顯示，對照組大鼠海馬組織存在DRP1和ENT1基礎表達，而模型組海馬組織DRP1和ENT1蛋白和mRNA的表達顯著增加。與模型組比較，使用芍藥苷對大鼠進行干預可顯著減少DRP1和ENT1蛋白和mRNA的表達水平，表明芍藥苷能夠抑制癲癇誘發的DRP1和ENT1異常高表達。

4 結論

芍藥苷可減輕癲癇誘發的海馬組織損傷和細胞凋亡，其作用機制可能與抑制DRP1和ENT1的活化有關。