NLRP3 mRNA表達水平與急性酒精性肝炎的相關性*

邢竹韻 吳亞云 王歡 鐘朕 申曉旭 袁春艷

(貴州醫科大學附屬醫院感染科，貴州 貴陽 550004)

酒精性肝炎(alcoholic hepatitis，AH)是我國常見肝病，患病率約為1.5%～2.3%，長期大量飲酒是AH的主要病因[1-2]。患者在大量飲酒后突然出現肝細胞大量壞死病理綜合征及一系列急性肝功能失代償癥狀表現為急性AH[3]，若發展為肝衰竭甚至肝性腦病可稱為急性重癥AH[4]。目前認為AH的發病機制是乙醇及乙醛代謝產物的肝臟毒素作用，在肝臟內代謝引起肝細胞功能嚴重紊亂，并誘導肝臟炎癥反應、氧化應激、免疫損傷[5]。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain like receptors family pyrin domain containing 3，NLRP3)是核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(NLRs)家族的成員之一，定位于胞質但可以識別胞內外信號，其中以NLRP3為核心的NLRP3炎性小體在炎癥反應免疫調節中起到重要作用[6-7]，NLRP3相關研究也是近年來的研究熱點。有研究發現[8-9]NLRP3炎性小體與AH具有關聯，在AH急性發病患者中可見血清NLRP3炎性小體水平上升，加重肝臟炎癥反應。NLRP3基因的信使核糖核酸(mRNA)攜帶遺傳信息指導NLRP3炎性小體蛋白表達，但未有研究深入分析NLRP3 mRNA是否參與AH發生發展，NLRP3 mRNA在AH發病機制中具有的作用仍不明確。因此，本研究探討了NLRP3 mRNA表達水平與AH的相關性，并分析NLRP3 mRNA參與AH的作用機制，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月～2020年10月我院收治的82例AH患者(AH組)。納入標準：①符合急性AH的診斷標準[10]，定義為大量飲酒后突然出現肝細胞大量壞死和急性肝功能失代償；根據國外相關指南[11-12]將急性重癥AH定義為Maddrey′s判別評分>32分或終未期肝病模型評分>20分，當血清總膽紅素>171 μmol/L并且凝血酶原活動度≤40%伴有明顯出血傾向時可診斷急性重癥AH肝衰竭。②男性。③近期1周內大量飲酒急性發病，日均飲酒≥80 g。④首次急性發病于我院就診，無既往病史，參與本研究所有檢驗項目前未接受治療。排除標準：①合并甲肝、乙肝等肝炎病毒感染。②繼發肝癌。③合并嚴重心腦血管疾病、腎功能不全、血液、免疫疾病。④合并其他原因引起的全身炎癥。⑤自身免疫性肝病。⑥藥物性肝炎。根據AH病情嚴重程度分為重癥AH組20例、輕癥AH組62例。選取同期收治的46例酒精性脂肪肝患者(脂肪肝組)以及30例健康體檢者(健康對照組)。本研究獲得醫院倫理委員會批準，患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血常規 抽取患者肘靜脈血5 mL，采用BC-5500五分類血細胞分析儀(邁瑞生物醫療有限公司)檢測中性粒細胞計數、淋巴細胞計數、中性粒/淋巴細胞比值(NLR)。

1.2.2 血生化 抽取患者肘靜脈血5 mL，3000 rpm轉速下分離血清。采用AU5800全自動生化分析儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)，根據分光光度法的原理檢測血清谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)，試劑盒均購自羅氏診斷產品(上海)有限公司；根據免疫比濁法的原理檢測血清白蛋白，試劑盒購自美國伯騰公司。根據膽紅素氧化酶法的原理檢測血清總膽紅素，試劑盒購自北京森美希克瑪生物有限公司。

1.2.3 NLRP3 mRNA ①抽取患者肘靜脈血5 mL(乙二胺四乙酸抗凝)，先分離單個核細胞，步驟為將1 mL全血加入2 mL離心管中，再加入等體積的外周血單個核細胞分離液液，混勻5 min，在室溫下以3500 rpm轉速離心10 min，棄上清液。37℃水浴60 min，加入蛋白酶K 3 μL混勻，55℃水浴箱溫育過夜，使細胞沉淀溶解。室溫下加入等體積的飽和酚，然后在4℃下以5000 rpm轉速離心10 min，使用移液器取上清液轉移至另一滅菌管中。再加入等體積的氯仿異戊醇，混勻后在4℃ 下以5000 rpm轉速離心10 min，使用移液器取上清液，轉移至另一滅菌管中。加入總RNA抽提試劑(Trizol試劑)抽提細胞總RNA，干燥RNA沉淀物，保存于-20℃待檢。②熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)：NLRP3 mRNA引物為生工生物工程(上海)有限公司負責設計，上游引物5′-CATGAGTGCTGCTTCGACAT-3′，下游引物5′-GC TTCAGTCCCACACAGA-3′。儀器設備包括PCR擴增儀(美國BioRad公司)、qRT-PCR試劑盒。qRT-PCR反應體系：10×擴增緩沖液10 μL，4種dNTP混合物100 μmol/L，引物5 μmol/L，模板DNA 0.5 μg，Taq DNA聚合酶10 U，MgCl2緩沖液1 mmol/L，雙蒸水100 μL。qRT-PCR反應條件：94℃ 5 min，94℃ 40 s，60℃ 40 s，72℃ 15 s循環30次，72℃延伸 10 min，最后4℃冷卻結束。參照qRT-PCR的說明書，采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。

2 結果

2.1 3組患者一般資料比較 3組患者的年齡、體質指數比較無統計學差異(P>0.05)。AH組的日均飲酒量大于脂肪肝組、健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 3組患者一般資料比較Table 1 Comparison of general information of patients in the three groups

2.2 3組患者血常規及血生化指標比較 AH組的中性粒細胞計數、NLR比值高于脂肪肝組、健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。3組患者淋巴細胞計數比較無統計學差異(P>0.05)。AH組的血清AST、血清ALT、AST/ALT比值、血清白蛋白、血清總膽紅素、血清ALP水平高于脂肪肝組、健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 3組患者血常規及血生化指標比較Table 2 Comparison of blood routine and blood biochemical indexes of patients in the three groups

2.3 3組患者NLRP3 mRNA比較 AH組的NLRP3 mRNA水平高于脂肪肝組、健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 3組患者NLRP3 mRNA比較Table 3 Comparison of NLRP3 mRNA in the three groups

2.4 輕癥、重癥AH患者NLRP3 mRNA比較 重癥AH組的NLRP3 mRNA水平高于輕癥AH組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 酒精性AH輕癥、重癥患者NLRP3 mRNA比較Table 4 Comparison of NLRP3 mRNA between mild and severe alcoholic AH

2.5 AH患者NLRP3 mRNA水平的相關性分析 AH病情程度與NLRP3 mRNA水平呈正相關(r=0.633，P<0.05)，NLRP3 mRNA水平越高AH患者的病情越嚴重。中性粒細胞計數、NLR比值、AST/ALT比值與NLRP3 mRNA水平呈正相關(r=0.392，r=0.337，r=0.252，P<0.05)，見表5。

表5 AH患者NLRP3 mRNA水平的相關性Table 5 Correlation of NLRP3 mRNA levels in AH patients

2.6 NLRP3 mRNA鑒別診斷AH以及評估AH病情程度的ROC曲線分析 ROC曲線可知(圖1)，AUC面積為0.916，當NLRP3 mRNA水平的最佳截斷值為1.62時，NLRP3 mRNA鑒別診斷AH的靈敏度為91.46%，特異度為77.63%。ROC曲線可知(圖2)，AUC面積為0.827，當NLRP3 mRNA水平的最佳截斷值為1.90時，NLRP3 mRNA評估AH病情程度的靈敏度為90.00%，特異度為72.58%，見表6。

圖1 NLRP3 mRNA鑒別診斷AHFigure 1 Differential diagnosis of NLRP3 mRNA for AH

圖2 NLRP3 mRNA評估AH病情程度Figure 2 NLRP3 mRNA to assess the severity of AH

表6 ROC曲線分析下的靈敏度、特異度Table 6 Sensitivity and specificity under ROC curve analysis

3 討論

AH的病理機制較為復雜，酒精及其代謝產物對肝實質細胞產生各種影響，包括氧化應激、無菌性炎癥反應、蛋白酶體功能改變等[13]。酒精暴露直接造成肝竇內皮細胞結構的完整性被破壞，肝細胞死亡，激活炎癥因子，加重了肝臟炎癥反應。有研究表示[14]重癥AH以及肝衰竭患者中全身炎癥反應綜合征和膿毒血癥的死亡率增加了3倍以上。隨著AH進展為肝纖維化，肝臟星狀細胞外出現基質蛋白質沉積，肝臟巨噬細胞參與免疫調節，釋放各種炎癥介質如腫瘤壞死因子α，還有激活氧化應激反應，產生超氧化物、羥基自由基等活性氧簇，破壞肝臟細胞的動態平衡，誘導肝臟細胞凋亡壞死[15]。傳統的炎癥指標如中性粒細胞以及肝功能生化指標可用來評估診斷AH，具有一定的臨床應用價值，但特異性較差，易出現誤診。本研究顯示，AH組的中性粒細胞計數、NLR比值高于脂肪肝組、健康對照組；AH組的血清AST、血清ALT、AST/ALT比值、血清白蛋白、血清總膽紅素、血清ALP水平高于脂肪肝組、健康對照組。上述與董德嘉等[16]研究報道相似，在AH初期中性粒細胞計數略微升高，淋巴細胞正常或略微下降，故NLR比值通常會上升。AST/ALT是檢測肝功能的常規指標，直接反映肝細胞損傷情況，不同階段AST/ALT比值存在不同，在AH初期肝臟細胞胞漿、線粒體中的酶大量進入血液，且以AST較多，故血清AST升高幅度通常高于ALT[17-18]。

AH的炎癥免疫機制是近年來的研究熱點，炎癥反應在AH中的作用機制越來越受到臨床重視，NLRP3在AH以及非AH肝炎、納米顆粒性肝損傷等肝臟疾病中的潛在作用引起了臨床醫生和研究人員的廣泛關注[19]。NLRP3炎性小體是炎癥反應通道的重要介質，具有特殊的作用，它通常在正常細胞中處于失活狀態[20]，當細胞受到氧化應激時NLRP3炎性小體被激活，并進一步活化白細胞介素等多種炎癥因子，若NLRP3炎性小體產生過多，加重了組織炎癥損傷，會導致肝臟靶細胞出現瀑布樣損害，甚至出現全身炎癥反應綜合征[21-22]。NLRP3炎癥小體是固有免疫中關鍵的胞質內感受器，通過感受不同的病原微生物或危險信號激活多種炎性因子的分泌并誘導細胞凋亡[23]，有研究[24]揭示了ABRO1介導BRISC復合體調控NLRP3去泛素化及活化的分子機制；也有研究指出[25-26]NLRP3炎性小體的激活依靠caspase-1及白細胞介素IL-1和IL-18炎癥介質系統。NLRP3炎性小體的不同尋常之處在于它可以由AH許多不同類型的刺激激活，但與AH其他分子上的相關性及相互作用仍不明確。本研究從分子生物學的角度探討NLRP3 mRNA與AH的關聯，結果發現AH組的NLRP3 mRNA水平高于脂肪肝組、健康對照組；并且重癥AH組的NLRP3 mRNA水平高于輕癥AH組；AH病情程度與NLRP3 mRNA水平呈正相關(r=0.633)，上述提示NLRP3 mRNA水平與AH的發生發展、病情嚴重程度具有密切關聯，這與張龍玉等[27]研究結論相似，該研究報道AH和AH肝硬化患者肝組織中的NLRP3 mRNA水平顯著高于正常組，這說明NLRP3 mRNA表達上調調控AH的發病。另外，本研究發現中性粒細胞計數、NLR比值、AST/ALT比值與NLRP3 mRNA水平呈正相關，也間接證實NLRP3 mRNA水平與肝功能損傷嚴重程度具有正相關關聯。

有研究[28]采用肝細胞重組實驗分析NLRP3激活AH炎癥反應的分子機制，發現在肝臟巨噬細胞中有一個共同的觸發信號，即高爾基反面網絡結構與NLRP3 mRNA上的多堿基區域相結合，誘導適配體蛋白聚合，從而激活了下游信號級聯，這也展示出高爾基體除了加工包裝蛋白質的基本功能，還在炎癥信號通路中具有特殊作用。對于NLRP3 mRNA在臨床上的應用價值，本研究ROC曲線顯示NLRP3 mRNA鑒別診斷AH的靈敏度為91.46%，特異度為77.63%；NLRP3 mRNA評估AH病情程度的靈敏度為90.00%，特異度為72.58%，均具有良好的靈敏度與特異度，對于AH患者檢測外周血NLRP3 mRNA水平可以預測病情嚴重程度，為患者預后提供參考。

4 結論

NLRP3 mRNA水平與急性酒精性肝炎的發生發展、病情嚴重程度具有密切關聯，發病機制可能與NLRP3 mRNA表達上調有關，NLRP3 mRNA對酒精性肝炎的病情嚴重程度具有一定的輔助診斷評估價值，臨床應用價值高。但本研究仍具有一定不足，如樣本量較少，病例均為男性，今后研究需要開展多中心研究以及體外實驗，進一步深入分析NLRP3 mRNA影響AH的機制，為AH疾病的靶向治療提供新的思路。