白介素-31基因多態性與隱睪發病易感性的相關性*

黃貴閩 曹貴華 唐鐵龍 譚春林

(1.樂山市人民醫院泌尿外科，四川 樂山 614000；2.川北醫學院附屬醫院，四川 南充 637000)

隱睪是新生男嬰最常見的先天性畸形之一，約30%的早產兒和3%～5%的足月兒患有隱睪[1]。隱睪是一種中度畸形，是發生不育和睪丸癌等并發癥的重要危險因素。隱睪常常作為一種孤立性疾病發生，其發病機制尚不完全清楚，但可能是多因素的，涉及遺傳和環境因素[2-4]。白介素-31(IL-31)是新近發現的GP130/IL-6細胞因子家族成員。IL-31主要由CD4+T細胞分泌。IL-31信號通過與IL-31受體A(IL-31RA)和抑瘤素M受體(OSMR)所組成的異源二聚體功能受體復合物結合而傳導，能在不同程度上激活Janus激酶/信號轉導和轉錄激活因子(JAK-STAT)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路[5-8]。促炎癥細胞因子IL-31能夠在眾多免疫過程中誘導IL-6的分泌，而IL-6基因的表達水平與隱睪發病風險呈正相關[9-10]。因此，推測隱睪發病可能與IL-31相關。研究表明，IL-31參與了神經、免疫、生殖、呼吸、運動等系統相關細胞的生長和發育。但至今尚無IL-31與隱睪發病的相關報道。本研究中，我們探究IL-31基因rs7977932(C/G)和rs4758680(C/A)多態性在中國人群隱睪的相關性，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年1月～2015年12月在川北醫學院附屬醫院和樂山市人民醫院接受診療的隱睪患者。所選取的隱睪患者(僅為孤立性隱睪病例)和健康個體進行病例-對照研究。這些患者在出生后不久便進行體格檢查，并在月齡3個月時再次進行檢查，以確定其隱睪情況。選取同期該院就診的無血緣關系并接受包皮切除術的健康人群作為對照組。早產兒、低出生體重嬰兒和有其他嚴重疾病或系統性疾病個人史或家族史的個體均不被納入研究范圍之內。本研究應用劉毅東[12]提及的隱睪的定義和相關體格檢查方法進行疾病的診斷。所有的檢查都是在溫暖的條件下對仰臥姿勢的孩子進行。睪丸在其正常下降的路徑上經過持續、穩定而非暴力的牽拉到最遠端的位置后被記錄為最終的睪丸位置。對于隱睪這一診斷在進行睪丸下降固定術前，即病人1歲左右時再次確認。在所有病例中，單側隱睪97例，雙側隱睪15例。在雙側隱睪病例中，隱睪患者睪丸位置由兩側較高者決定并記錄。共有32例、27例、24例、19例和10例隱睪患者的睪丸位置分別位于腹股溝淺囊、陰囊上區、外環口、腹股溝管和內環口。對照組人群均于川北醫學院附屬醫院接受包皮切除術。所有研究對象(包括病例組和對照組)均為中國西南地區四川省的漢族人群。本研究經川北醫學院附屬醫院、樂山市人民醫院倫理委員會批準。所有研究對象的父母都得到書面同意書并簽字同意參加這項研究，對每名隱睪患者和對照組抽取5毫升外周靜脈血以備DNA提取。

1.2 DNA提取和基因分型 分別對IL-31基因rs7977932和rs4758680兩個單核苷酸多態位點(SNP)進行基因分型。每個樣本的基因組DNA是適量EDTA抗凝外周血樣品中采用DNA分離試劑盒(BioTeke，北京，中國)提取。操作程序按照制造商說明書執行。采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性方法對所選的2個SNP進行基因分型。使用引物設計軟件Primer 3設計引物(http://bioinfo.ut.ee/primer3-4.0/primer3/)，見表1。PCR反應體系中分別含PCR緩沖液，基因組DNA和0.1 μL的擴增引物等。待PCR反應結束后用相應的內切酶對產物分別進行酶切、聚丙烯酰胺凝膠電泳、硝酸銀染色等步驟。最后再隨機選取15%樣本采用DNA測序方法重復測量，兩次分型結果完全一致。

1.3 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。通過直接計數獲得2個SNPs的基因型頻率。采用卡方(2)檢驗對對照組人群進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗。利用優勢比(odds ratio,OR)和95%置信區間(confidence interval,CI)評價病例組和健康對照組在等位基因與基因型間差異。P<0.05為差異有統計學意義，所有統計檢驗均為雙側概率檢驗。使用在線軟件SNPstats(https://www.snpstats.net/snpstats/)對此病例對照研究的基因型相關性檢驗，遺傳模型分別包括共顯性、顯性、隱性和超顯性。

2 結果

2.1 兩組IL-31基因的單核苷酸多態位點等位基因頻率比較 本研究最終成功對112例病例組和425例對照組進行基因分型。對照組的IL-31基因多態位點rs4758680和rs7977932的基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡(rs4758680:2=1.44,P>0.05,rs7977932:2=0.62,P>0.05)。病例組和對照組的2個SNPs的等位基因頻率分布情況，見表2。rs7977932位點的等位基因頻率分布在病例組和對照組之間無顯著性差異(P>0.05)。對rs 4758680而言，病例組rs4758680的C等位基因頻率明顯高于對照組(89%vs83%)；相反，病例組rs4758680的A等位基因頻率較對照組有所下降(11% vs 17%)。隱睪風險顯著降低與rs4758680位點的A等位基因相關(P=0.02，或=0.58，95% CI=0.37～0.92)。

表2 病例組及對照組IL-31基因的單核苷酸多態位點等位基因頻率比較[n(×10-2)]Table 2 Allele frequencies of SNPs in interleukin-31 gene among patients and controls and their association with cryptorchidism risk

2.2 兩組IL-31基因rs7977932基因頻率比較 對IL-31基因rs7977932位點基因多態性分析表明，病例組與對照組的基因型頻率分布在共顯性、顯性、隱性和超顯性遺傳模型上均無統計學差異，見表3。

表3 病例組及對照組IL-31基因rs7977932基因型頻率比較[n(×10-2)] Table 3 Genotype frequencies of SNP rs7977932 in interleukin-31 gene among patients and controls and their association with cryptorchidism

2.3 兩組I-31基因rs4758680基因型頻率分布 IL-31基因rs4758680位點基因型頻率在共顯性、隱性、超顯性三種基因模型下，病例組與對照組相比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；而在顯性基因模型中，病例組中CC基因型頻率(79.5%)明顯高于對照組中CC基因型頻率(69.2%)；病例組中A堿基攜帶者(CA/AA基因型)頻率在中顯著低于對照組(20.5% vs 30.8%)，差異有統計學意義(OR=0.58,95%CI=0.35～0.96,p=0.03)，見表4。

表4 病例組及對照組IL-31基因rs4758680基因型頻率分布[n(×10-2)] Table 4 Genotype frequencies of SNP rs4758680 in interleukin-31 gene among patients and controls and their association with cryptorchidism

3 討論

人類的IL-31基因位于染色體12q24.13上，該基因可以編碼一個由164個氨基酸組成的蛋白質[15]。IL-31是一種多向性細胞因子，具有造血調節、免疫、細胞增殖、細胞因子和趨化因子的誘導等多種生物學功能；IL-31及其受體通路在多種免疫和炎性反應中發揮其生物學功能，引起如炎癥性腸病、類風濕關節炎、支氣管哮喘和各型皮炎等在內的各種自身免疫疾病和變態反應性疾病[16-18]。Potashnik H等[19]人報道了在體外條件下，IL-6的分泌伴隨著異常數量的睪酮，而性發育不成熟小鼠睪丸組織中IL-6基因表達水平顯著高于其在成熟小鼠睪丸內的水平，故IL-6可能參與調節睪丸發育、生長、增殖和分化等重要生理功能。有趣的是，IL-31作為一種新近發現的炎癥細胞因子，能夠在多種不同類型的細胞中有效誘導促炎癥介質的釋放，而這其中就包括IL-6[17-18，20]。因此，我們猜測IL-31可能通過某種途徑影響IL-6的釋放，并有可能進一步影響隱睪的發展。

基因多態性包括DNA片段長度多態性、DNA重復序列多態性、單核苷酸多態性(SNP)等種類，且以后者最為多見。SNP可以作為疾病的病因、發病危險因素，也可做為腫瘤標記物、生物標記物診斷某疾病，而且在評估治療方案的治療效果，判斷某個藥物的不良反應及腫瘤的生存和預后等方面都有廣泛的研究。目前國內外尚無IL-31基因多態性與隱睪發病易感性之間相關性的研究[21-23]。本研究首次探究并證實了中國人群隱睪發病易感性與IL-31基因多態性的相關性。本研究中所選擇的兩個IL-31基因的單核苷酸多態位點均位于內含子區域。對于rs4758680，在顯性遺傳模型中，患者與對照組之間的基因型頻率分布差異具有統計學意義。雖然單核苷酸多態位點rs4758680位于非編碼區，但其可能通過影響其他基因的表達產物而不是通過改變IL-31基因中的氨基酸序列影響IL-31的結構和功能進而改變隱睪發病的易感性。我們本研究所得到的數據與IL-31基因多態性擴張性心肌病及系統性紅斑狼瘡的遺傳易感性的相關性研究結果相似[15,24]。越來越多的證據表明，位于非編碼區的內含子可以通過一種特殊的機制啟動和增強基因在廣泛的生物群體中的表達，這種機制被稱為內含子增強效應[25]。盡管本實驗中單核苷酸多態位點rs7977932與隱睪發病易感性之間沒有發現顯著的相關性，但這一觀察結果可能是由于本研究中樣本有限所致。因此，本實驗不能得出rs7977932的SNPs與隱睪發病易感性不相關的結論，同時也應該在更大的研究樣本中進一步驗證本實驗結果的可靠性。我們的研究結果為炎癥相關因子IL-31基因多態性與隱睪的易感性的相關性提供了證據。

IL-31的基因多態性或血清表達水平已經被用來確定多種疾病的易感性、預后或轉歸[15,26,27]。本研究探討了IL-31基因在隱睪發病中的潛在作用，并成功地確定了IL-31基因SNP與隱睪發病易感性之間的相關性。IL-31基因SNP等位基因和基因型頻率在隱睪患者與對照組之間也有顯著性差異。提示rs4758680位點的C等位基因可能是主要的易感因素。此外，rs4758680位點的A等位基因攜帶者(C/A-A/A基因型)可作為中國人群隱睪的一種新的保護因素。

4 結論

IL-31基因多態性與中國人群隱睪的遺傳易感性有關。與CC基因型相比，rs4758680的A等位基因攜帶者(CA/AA基因型)是隱睪遺傳易感性的保護因素。