糖分含量對番茄葉片Pst DC3000抗性的影響及其機理

趙 虎，張越亭，劉永華

(海南大學 園藝學院，海南 海口 570228)

番茄(Solanumlycopersicum)是世界上重要的蔬菜作物之一。據聯(lián)合國糧農組織統(tǒng)計，2018年世界番茄總產量高達1.82 億t，其中我國番茄總產量為0.62億t，占比34%(FAO，2018)。番茄在實際生產中病害發(fā)生嚴重，其中Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000 (Pst DC3000)引起的細菌性葉斑病危害番茄葉片、葉柄、莖、花和果實，對番茄質量和產量均會產生嚴重不利影響[1-3]。該病害一般會導致番茄減產10%～30%，嚴重時達到50%以上[4]。Pst DC3000可在田間存活較長時間，并通過整枝、打杈、采收等相關農業(yè)活動進行傳播或再侵染，病菌在田間進行多次重復再侵染，加重危害，防治較為困難[5]。田間長期使用殺菌劑不僅導致病菌產生抗藥性，而且會造成環(huán)境污染和食品安全等問題。因此，亟需深入了解番茄對Pst DC3000的防御機制，以期培育出抗細菌性葉斑病的番茄新品種。

糖代謝在植物對病原菌的防衛(wèi)反應中發(fā)揮著重要作用。一方面，糖代謝可為植物提供碳骨架和能量，用于細胞壁加厚、植物抗毒素的合成，以及抗病相關蛋白的積累等防衛(wèi)反應[6]；另一方面，糖分(如葡萄糖和果糖)也可作為信號分子調節(jié)抗病相關基因表達[7-8]。除了增加植物的抗性外，糖代謝產生的葡萄糖和果糖也可以為病原菌的生長發(fā)育提供養(yǎng)分，從而導致植物發(fā)病[9]。因此，糖代謝在植物-病菌互作中發(fā)揮著雙重作用，既可能增強植物抗性，也可能會促進病菌發(fā)育，導致植物發(fā)病。根據糖分對病原菌致病性的影響可將病原菌分為兩大類：低糖病原菌(如番茄早疫病病原菌Alternariasolani)和高糖病原菌(如侵染禾本科作物的銹病和白粉病病原菌)，這兩大類病原菌分別在植物組織中糖分含量低和高的時候顯示出高致病性[10]。研究表明，改變植物組織中的糖分含量則會改變植物對相應病原菌的抗性。例如利用外源激動素馬來酰肼(maleic hydrazide)處理提高番茄葉片中的糖含量，就會導致番茄葉片對低糖病原菌Alternariasolani的抗性增加[10]。然而，目前尚不清楚植物組織中糖分含量影響其抗病性的具體機制。

植物可通過光合作用把CO2轉化為碳水化合物。在大部分植物中，蔗糖(sucrose，Suc)作為最終的光合產物通過韌皮部從光合葉片運輸到各類庫器官中(如果實、花、嫩葉、莖和根)。在植物體內，Suc只有分解為葡萄糖(glucose，Glc)和果糖(fructose，F(xiàn)ru)后才能被用于植物防衛(wèi)反應或者被病原菌吸收利用[6，11]。植物體內參與Suc分解的酶主要分為兩種：蔗糖合成酶(sucrose synthase，Sus)和蔗糖轉化酶(invertase，INV)。Sus在細胞質內將Suc分解為 UDP-Glc和Fru，該反應為可逆反應，而INV則不可逆地將Suc水解為Glc和Fru[12-13]。依據亞細胞定位的不同，可將INV進一步細分為3種：細胞壁轉化酶(cell wall invertase，CWIN)、液泡轉化酶(vacuolar invertase，VIN)和細胞質轉化酶(cytoplasmic invertase，CIN)[14]。

目前的研究主要集中在CWIN對植物抗病性的影響上，因為和其他3種蔗糖分解酶相比，CWIN在植物抗病性方面具有一定的特殊性：首先，CWIN通過在質外體空間將Suc分解為Glc和Fru，能夠促進韌皮部中的Suc向病菌侵染部位的轉運和卸載，進而為活性氧(ROS)積累、細胞死亡基因的誘導以及抗氧化化合物(包括谷胱甘肽、抗壞血酸和果聚糖)和防御信號分子(JA和SA)等的合成提供充足的糖分供應[9，14-17]。其次，CWIN在質外體空間水解Suc 生成的Glc和Fru可以作為信號分子激活植物抗病相關基因表達[9，14]。再次，病原菌可從植物質外體空間吸收CWIN水解蔗糖產生的Glc和Fru來維持其生長發(fā)育[11]。因此，CWIN可以通過調控質外體空間Suc的水解速度和己糖(Glc和Fru)的含量來影響病原菌的生長以及植物的防衛(wèi)反應。

已有的研究表明，CWIN在植物抗病中的具體作用可能受到病原菌類型(死體營養(yǎng)型或活體營養(yǎng)型)的影響：CWIN在植物抗死體營養(yǎng)型病菌中發(fā)揮積極作用。例如，通過RNA干擾技術抑制煙草中CWIN的表達導致植株對死體營養(yǎng)型卵菌病菌Phytophthoranicotianae的抗性降低[17]。CWIN在植物抗活體營養(yǎng)型病菌中發(fā)揮著負面作用。例如，番茄CWIN基因LIN8的沉默不僅沒有降低番茄植株的抗性，反而增加了對活體營養(yǎng)型細菌病菌Xanthomonascampestrispv.vesicatoria(Xcv)的抗性[18]。同樣，通過超表達CWIN抑制因子的方法降低CWIN的活性導致擬南芥對活體營養(yǎng)型真菌病菌Plasmodiophorabrassicae的抗性增加[19]。此外，CIN也在植物抵御病菌侵染中發(fā)揮著重要作用。對小麥的研究表明，CIN基因Ta-A/N-Inv1的下調增強植株對條銹病病菌Pucciniastriiformis的抗性[20]。目前有關VIN和Sus在植物抗病中作用的研究則較少。推測植物組織中糖分含量對植物抗病性的具體影響可能與植物組織中轉化酶的活性變化以及病菌的種類有關。

目前尚不清楚番茄葉片中的糖分含量變化是否會對其Pst DC3000抗性產生一定的影響及其具體的作用機制是否涉及到轉化酶、ROS(如H2O2)和抗病激素水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)等。我們分別在早上8：00和晚上6:00對番茄葉片進行取樣，對其在Pst DC3000抗性、淀粉和可溶性糖(Suc、Glc和Fru)含量方面的差異進行測定，以闡明番茄葉片中的糖分含量變化對其Pst DC3000抗性的影響；此外，通過對番茄葉片進行轉化酶活性測定、H2O2原位染色以及SA和JA含量測定，以初步闡明糖分含量影響番茄葉片Pst DC3000抗性的生理生化機制，為下一步通過轉基因和分子育種等現(xiàn)代生物技術手段提高番茄對Pst DC3000的抗性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用番茄品種為新疆農業(yè)科學院園藝研究所培育的新番2號。取40粒種子進行消毒滅菌處理：用 70%無水乙醇浸泡并振蕩1 min，蒸餾水清洗2遍。然后用0.4%NaClO溶液浸泡5 min，蒸餾水清洗4遍。之后將種子放到底部墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿內，27℃恒溫催芽5 d。待種子發(fā)芽后，再將種子播種至24孔的穴盤內，播種基質為2～6 mm 蛭石。待子葉長出來后，開始澆施1/2倍的園式營養(yǎng)液。栽培20 d后，將4葉1心的番茄苗移栽至混合基質中(土∶泥炭∶蛭石體積比4∶1∶1)，于海南大學園藝學院蔬菜實驗教學基地鋸齒溫室盆栽種植，并施用一定量復合肥(N15%，P2O515%，K2O 15%)作為基肥。之后每2 d澆一次水，番茄大約生長5周后，從番茄植株頂端往下選取第3～4葉位上大小和形狀差異不大且葉面較為平整的葉片進行Pst DC3000接種實驗。

1.2 方法

1.2.1 病菌的培養(yǎng)和接種方法

接種Pst DC3000的方法參照Katagiri等[21]并適當調整。在超凈工作臺內，用滅過菌的牙簽將平板上的Pst DC3000菌落刮下來，移到100 mL錐形瓶中，加入液體KB培養(yǎng)基50 mL，在溫度為28 ℃，180 r·min-1的黑暗條件下進行搖菌培養(yǎng)36 h。將上述50 mL液體培養(yǎng)基用水平離心機在2 500×g下離心10 min，倒去上清液，得到細菌沉淀，加入無菌水將細菌沉淀制成懸浮液并將細菌濃度調整為2×108CFU·mL-1用于離體接種實驗。

具體離體接種方法如下：在直徑為11 cm的塑料培養(yǎng)皿中倒入70 mL質量分數為0.8%的瓊脂，待瓊脂冷卻凝固。用蒸餾水將番茄葉片的表面清洗干凈，并用吸水紙將葉面的水吸干，用鑷子夾取清洗好的葉片整個浸沒在上述濃度菌液中10 s，對照則浸沒在無菌水中。然后將上述葉片的葉柄插入培養(yǎng)皿的瓊脂中并保持葉片表面平整。封口膜密封后，在 23 ℃下培養(yǎng)2 d(黑暗8 h，18 ℃；光照16 h，4 000 lx，23 ℃)。對接種后0、24、48 h分別進行觀察并取樣，取樣時以接種部位為中心，稱取0.15 g樣品，液氮速凍后在-80 ℃保存，用于測定蔗糖轉化酶活性、可溶性糖和淀粉含量、SA和JA含量等。每個處理均包含4個生物學重復。

1.2.2 蔗糖轉化酶活性和可溶性糖含量的測定

INV活性的測定參照Tomlinson[22]的方法; 蔗糖、葡萄糖、果糖含量的測定參照King等[23]的酶學方法。

1.2.3 細胞死亡染色和激素的測定

番茄葉片在接種后0、24和48 h進行細胞死亡染色，具體方法參照 Bai等[24]的方法。將番茄葉片在1∶1的乙醇和染色液(將10 mL乳酸、10 mL甘油、10 g苯酚和10 mg臺盼藍溶于10 mL蒸餾水中)配制的混合液中煮沸5 min進行染色，然后在2.5 g·mL-1的水合氯醛溶液中進行脫色處理，最后對葉片進行拍照。游離態(tài)SA、結合態(tài)SA以及JA含量的測定參照Yin等[25]方法。

1.2.4 淀粉和H2O2原位染色

葉片淀粉染色參考 Sosso等[26]的方法。將番茄葉片在95%乙醇中煮沸30 min將葉綠素完全去除，然后將葉片在I2-KI溶液(將1 g碘和1 g碘化鉀溶于100 mL水中) 中染色5 min，然后用清水浸泡30 min后再沖洗2次，最后進行拍照記錄。葉片H2O2染色參考 Thordal-Christensen等[27]的方法，將番茄葉片放入1 mg·mL-1的DAB(3，3′-diaminobenzidine)溶液中，在-80 kPa下抽真空7 min(共重復3次，中間輕輕振蕩去除葉片表面的氣泡)，然后避光室溫下放置30 min。最后在95%乙醇中煮沸10 min去除葉綠素后進行拍照，存在H2O2的部位在染色后呈棕紅色。

1.3 統(tǒng)計分析

利用Excel 2010軟件對試驗數據進行作圖并用SPSS軟件進行t-test分析。

2 結果與分析

2.1 早、晚取樣葉片在Pst DC3000抗性上的差異

分別在早上8：00和晚上6：00對番茄葉片進行取樣，然后立即對其進行離體病菌接種，分別于接種后24、48 h對番茄葉片的發(fā)病情況進行觀察。結果發(fā)現(xiàn)，早上取樣葉片在接種后24 h即出現(xiàn)葉片輕微皺縮和局部發(fā)黃的癥狀，在接種后48 h可觀察到明顯的褐色病斑(圖1-A)；但晚上取樣葉片在接種后24和48 h均未出現(xiàn)明顯病斑，只是在接種后48 h出現(xiàn)輕微的皺縮現(xiàn)象。

在此基礎上，進一步對早、晚取樣葉片進行臺盼藍染色，以觀察接種Pst DC3000后葉片中細胞死亡情況(圖1-B)。在接種后0 h，早、晚取樣葉片均未出現(xiàn)藍色的細胞死亡信號；接種后24 h，早、晚取樣葉片都出現(xiàn)藍色的細胞死亡信號(圖1-B中箭頭所示)，且早上取樣葉片的藍色信號出現(xiàn)的范圍要大于晚上取樣葉片；接種后48 h，早、晚取樣葉片都出現(xiàn)藍色的細胞死亡信號均進一步加重，且早上取樣葉片加重的程度明顯高于晚上取樣葉片。值得注意的是，雖然晚上取樣葉片在接種后24 h未出現(xiàn)明顯的病斑，但是已經發(fā)生細胞死亡現(xiàn)象。此外，我們對接種后葉片中的Pst DC3000細菌密度進行了測定，結果發(fā)現(xiàn)，接種0 h，番茄葉片中檢測不到Pst DC3000細菌的存在，但在接種后24和48 h番茄葉片中的細菌密度快速上升，且早上取樣葉片中的細菌密度極顯著(P≤0.01)高于晚上取樣葉片(圖1-C)。總之，對葉片病斑、細胞死亡和細菌密度的測定表明，晚上取樣葉片對Pst DC300的抗性要高于早上取樣葉片。

A和B中標尺均代表 1.25 cm；B中箭頭表示藍色細胞死亡信號出現(xiàn)的部位；C中**表示早、晚取樣葉片之間存在極顯著(P≤0.01)差異。All scale bars in A and B represented 1.25 cm; Arrows in B indicated blue signals of cell death; ** in C indicated significant (P≤0.01) differences between morning- and evening-sampled leaves.圖1 接種Pst DC3000后0、24和48 h番茄葉片病斑、細胞死亡和細菌密度的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes in disease lesion，cell death and bacteria density in tomato leaves at 0，24 and 48 h after inoculation with Pst DC3000

2.2 接種后早、晚取樣葉片在淀粉和可溶性糖含量上的差異

首先對接種后的葉片進行淀粉原位染色(圖2-A)。結果表明，在接種0 h時，早上取樣葉片中的藍黑色淀粉信號主要集中在葉片中間部位，在葉片邊緣局部位置的藍黑色淀粉信號較弱，而晚上取樣葉片的淀粉在整個葉片范圍內分布較均勻。接種后24、48 h，早、晚取樣葉片中的淀粉信號均隨接種時間延長而下降，且早上取樣葉片淀粉信號隨接種時間增加消失更為明顯，至接種后48 h淀粉信號基本消失，而晚上葉片內的淀粉信號消失較慢，至接種后48 h仍有較強的淀粉信號。在整個接種時期內(0～48 h)，晚上取樣葉片中的淀粉信號一直高于早上取樣葉片。為驗證上述結果，我們對接種后葉片中的淀粉含量進行定量測定，結果發(fā)現(xiàn)，晚上取樣葉片中的淀粉含量極顯著高于早上取樣葉片(P≤0.01)，在接種后0、24和48 h，晚上取樣葉片的淀粉含量分別為早上取樣葉片的133%、268%和529%(圖2-B)。

A中標尺均代表 1.25cm；B中**表示早、晚取樣葉片之間存在極顯著(P≤0.01)差異。All scale bars represented 1.25 cm in A; ** in B indicated significant(P≤0.01) differences between morning- and evening-sampled leaves.圖2 接種Pst DC3000后早、晚取樣葉片淀粉原位染色和含量上的差異Fig.2 The differences of morning- and evening-sampled leaves in in situ starch staining and starch content after inoculated with Pst DC3000

在接種后0、24 h，晚上取樣葉片的葡萄糖(Glc)含量分別顯著(P≤0.05)、極顯著(P≤0.01)高于早上取樣葉片，前者分別為后者的451%和445%(圖3-A)；但在接種后48 h，則表現(xiàn)為晚上取樣葉片顯著(P≤0.05)低于早上取樣葉片。在接種后0h，早上取樣葉片和晚上取樣葉片的果糖(Fru)含量無顯著差異；但在接種后24～48 h，由于早上取樣葉片的Fru含量持續(xù)下降，而晚上取樣葉片的Fru含量基本沒有明顯下降，最終導致在接種后24和48 h晚上取樣葉片的Fru含量顯著(P≤0.05)高于早上取樣葉片(圖3-B)。與Glc和Fru不同，接種后0～48 h番茄葉片中的蔗糖(Suc)含量不但沒有下降，反而呈現(xiàn)上升的趨勢，且在接種后0～48 h內，早、晚取樣葉片的Suc含量沒有顯著差異(圖3-C)。

此外，早、晚取樣葉片在己糖/蔗糖比值上也存在較大的差異，晚上取樣葉片的己糖/蔗糖比值在接種后0和24 h顯著(P≤0.05)高于早上取樣葉片(圖3-D)，但在接種后48 h無顯著差異。總體來講，和早上取樣葉片相比，晚上取樣葉片在接種后具有較高的淀粉和己糖含量以及己糖/蔗糖比值。

圖中*和**分別表示早、晚取樣葉片之間在0.05和0.01水平上存在顯著差異。下同。* and ** indicated significant differences between morning- and evening-sampled leaves at 0.05 and 0.01 levels，respectively. The same as below.圖3 接種Pst DC3000后早、晚取樣葉片在可溶性糖含量和己糖/蔗糖比值上的差異Fig.3 Differences of morning- and evening-sampled leaves in soluble sugar content and hexose/sucrose ratio after inoculated with Pst DC3000

2.3 接種后早、晚取樣葉片在INV活性上的差異

大量研究表明，轉化酶(INV)在植物抗病中發(fā)揮著重要的作用[9，28]，因此，我們對早、晚取樣葉片在接種Pst DC3000后的3種INV活性進行了測定。結果表明，接種后早、晚取樣葉片的細胞壁轉化酶(CWIN)活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(圖4-A)；但晚上取樣葉片的CWIN活性在接種后0和48 h分別極顯著(P≤0.01)、顯著(P≤0.05)低于早上取樣葉片。此外，早、晚取樣葉片的細胞質轉化酶(CIN)在接種后0 h無顯著差異，但由于早上取樣葉片的CIN活性在接種后24～48 h呈現(xiàn)不斷下降的趨勢，而晚上取樣葉片的CIN活性在接種后呈現(xiàn)上升的趨勢，最終導致晚上取樣葉片的CIN活性在接種后24和48 h顯著(P≤0.05)高于早上取樣葉片(圖4-B)。早、晚取樣葉片的液泡轉化酶(VIN)活性在整個接種期間無顯著差異(圖4-C)。總體來說，接種后早、晚取樣葉片在CWIN和CIN活性上存在顯著差異，這可能是導致兩者在抗病能力上存在差異的重要原因。

圖4 接種Pst DC3000后早、晚取樣葉片在轉化酶活性上的差異Fig.4 Differences of morning- and evening-sampled leaves in invertase activities after inoculated with Pst DC3000

2.4 接種后早、晚取樣葉片在H2O2積累上的差異

植物在受到病菌侵染后往往會導致H2O2含量的上升，從而起到殺滅病原菌，阻止發(fā)病的作用[29]。但過量的H2O2則會導致植物細胞死亡，加速發(fā)病過程。通過對接種后葉片中的H2O2進行原位染色，我們發(fā)現(xiàn)在接種后0h，早、晚取樣的葉片中都沒有檢測到明顯的H2O2信號(圖5)；在接種后24 h，在早、晚取樣葉片的局部均出現(xiàn)微弱的棕色H2O2信號(如圖中箭頭所示)且早、晚葉片之間差異不大；而在接種后48 h，兩種葉片中的H2O2信號均呈現(xiàn)顯著增加的趨勢，其中晚上取樣葉片增加的幅度要明顯低于早上取樣葉片，導致早上取樣葉片中的H2O2信號強度顯著高于晚上取樣葉片。

圖A中標尺均代表 1.25 cm，圖B中*和**分別表示早、晚取樣葉片之間在0.05和0.01水平上存在顯著差異。All scale bars in A represented 1.25 cm； * and ** in B indicated significant differences between morning- and evening-sampled leaves at 0.05 and 0.01 levels，respectively.圖5 接種Pst DC3000后早、晚取樣葉片在H2O2原位染色、SA和JA含量上的差異Fig.5 Differences of morning- and evening-sampled leaves in in situ H2O2 staining and the content of SA and JA after inoculated with Pst DC3000

2.5 接種后早、晚取樣葉片在SA及JA含量上的差異

植物激素水楊酸(SA)和茉莉酸(JA)在植物抗病性中發(fā)揮著重要的作用[30-31]。利用高效液相色譜法對接種后48 h番茄葉片中的SA和JA含量進行了測定。結果表明，接種后48 h，晚上取樣葉片的游離態(tài)SA含量顯著(P≤0.05)高于早上取樣葉片，JA含量極顯著(P≤0.01)高于早上取樣葉片，但晚上取樣葉片的結合態(tài)SA含量極顯著(P≤0.01)低于早上取樣葉片(圖5-B)。推測早、晚取樣葉片在游離SA和JA含量上的差異可能也是導致兩者在抗病性上存在差異的重要原因之一。

3 討論

蔗糖代謝不僅能為植物的防衛(wèi)反應提供能量和碳骨架，用于各類抗菌物質的合成，其分解產生的葡萄糖和果糖也可作為信號分子調控植物相關抗病基因的表達[6]。此外，植物組織中的己糖(主要是葡萄糖和果糖)還是絕大部分的病菌生長發(fā)育所需的養(yǎng)分和能量。因此，植物組織內糖分含量的高低不僅會影響植物的抗病能力，還會影響病原菌的生長繁殖。根據病原菌對植物組織內糖分含量的要求，病菌可分為高糖病原菌和低糖病原菌[10]。本研究結果表明，和早上取樣葉片相比，晚上取樣葉片對Pst DC3000具有更高的抗性，表現(xiàn)為較輕的病斑和細胞死亡現(xiàn)象，同時葉片內的細菌密度也極顯著降低(圖1)。對接種后葉片中淀粉和可溶性糖含量的測定表明，晚上取樣葉片的淀粉含量在接種后0～48 h內均極顯著高于早上取樣葉片(圖2)；此外，晚上取樣葉片在接種后0和24 h的葡萄糖含量以及24 h和48 h的果糖含量也顯著高于早上取樣葉片(圖3-A、B)。雖然接種后早、晚取樣葉片的蔗糖含量沒有顯著差異(圖3-C)，但總體來講，在整個接種時期內(0～48 h)，晚上取樣葉片具有相對較高的碳水化合物含量，這表明Pst DC3000可能屬于低糖病原菌，晚上取樣葉片中糖分含量升高可能是導致番茄對Pst DC3000的抗性增強的重要原因。

早、晚取樣葉片不僅在淀粉和可溶性糖含量上存在較大差異，而且兩者在轉化酶活性上也存在較大差異。具體來講，晚上取樣葉片在接種后0和48 h的CWIN活性顯著低于早上取樣葉片，而接種后24和48 h其CIN活性則顯著高于早上取樣葉片(圖4-A、B)，但早、晚取樣葉片在VIN活性上無顯著差異(圖4-C)。已有的轉基因證據表明，CWIN在植物抗病中發(fā)揮著重要作用，且 CWIN在植物抗死體營養(yǎng)型病菌中發(fā)揮積極作用[17]，但在植物抗活體營養(yǎng)型病菌中發(fā)揮著負面作用[18-19]。由于Pst DC3000也屬于活體營養(yǎng)型病菌[31]，因此我們推測晚上取樣葉片對PstDC3000抗性的增加在很大程度上與其具有較低的CWIN活性有關。可能的機制有兩個：首先，CWIN可影響抗病激素SA和JA的合成。研究表明，植物CWIN活性和SA含量之間呈負相關，例如，玉米的CWIN突變體miniature籽粒中的CWIN活性幾乎完全消失，但其SA含量上升了10倍[32]。同樣，利用外源施用阿卡波糖(acarbose)的方法降低擬南芥葉片中的CWIN活性導致其SA水平大幅上升[33]。本研究結果表明，伴隨著CWIN活性的降低，晚上取樣葉片中不僅具有較高的游離SA含量，同時也具有較高的JA含量(圖5-B)。研究表明，增加空氣中的CO2濃度可通過增加番茄葉片中的SA和JA含量來提高番茄葉片對Pst DC3000的抗性[34]。因此，可以認為晚上取樣葉片中較低的CWIN活性導致SA和JA含量上升，從而提高了番茄葉片對Pst DC3000的抗性。其次，CWIN會對質外體空間的己糖含量產生影響。大量研究表明，病菌侵染植物后會誘導CWIN活性的上升，由于CWIN是在質外體空間將蔗糖水解為葡萄糖和果糖，因此病菌侵染誘導的CWIN活性上升往往會增加植物質外體空間的己糖含量，從而有利于病菌的生長[28]。我們的研究表明，接種Pst DC3000后，早、晚取樣葉片的CWIN活性也受到誘導(圖4-A)，但在接種0～48 h，晚上取樣葉片的CWIN活性始終低于早上取樣葉片，這可能會導致晚上取樣葉片質外體空間的糖分含量低于早上取樣葉片，從而抑制病菌的侵染。本研究只是測定了葉片中總的己糖含量，而沒有區(qū)分細胞內和細胞外的己糖含量，因此，在將來的研究中應進一步測定接種后早、晚取樣葉片在質外體空間(即細胞外)己糖含量上的差異。

此外，晚上取樣葉片中較高的CIN活性可能通過增加番茄的抗氧化能力來提高其抗病能力。蔗糖分解產生的己糖(葡萄糖和果糖)可通過糖酵解和磷酸戊糖途徑促進還原力(NADH和NADPH)和抗氧化物(如抗壞血酸和谷胱甘肽等)的合成，從而清除脅迫條件下產生的過量活性氧(如H2O2)并減少氧化脅迫所導致的細胞死亡現(xiàn)象[35]。雖然植物中存在4種蔗糖分解酶，但已有的研究表明，只有CIN介導的蔗糖分解與脅迫條件下植物的抗氧化能力密切相關。例如，在擬南芥原生質體中超表達CIN，可顯著減輕外源H2O2處理所導致的氧化脅迫[36-37]。本研究表明，在3種轉化酶中，只有CIN的活性表現(xiàn)為晚上取樣葉片顯著高于早上取樣葉片(圖4-B)，因此晚上取樣葉片中更高的己糖含量應該來自于CIN介導的蔗糖分解(圖3-A、B)。同時，晚上取樣葉片中的細胞死亡現(xiàn)象和H2O2含量均顯著低于早上取樣葉片(圖1-B、圖5-A)。據此推測晚上取樣葉片中較高的CIN活性可通過產生足夠的己糖來提高葉片清除過量的活性氧(如H2O2)的能力，從而避免病菌侵染誘導的氧化脅迫所導致的細胞死亡，最終提高葉片的抗病能力。

最后，糖信號途徑可能也參與番茄葉片的抗病反應。晚上取樣葉片的己糖含量顯著高于早上取樣葉片，而蔗糖含量在早、晚取樣葉片之間沒有顯著差異，這導致晚上取樣葉片的己糖/蔗糖比值顯著高于早上取樣葉片。研究表明，增強的己糖信號(即高己糖/蔗糖比值)可以誘導植物的一系列防御反應如超敏反應(HR)、細胞壁加厚、抗病相關次生代謝物的合成(如phytoalexin)、晝夜節(jié)律以及氣孔開度的變化等[28-29，38]。因此，晚上取樣葉片中高的己糖/蔗糖比值可能會通過己糖信號誘導一系列植物抗病反應的發(fā)生，從而來增加番茄葉片的抗病能力。在下一步的研究中應加強己糖信號方面的研究。

總之，雖然晚上取樣葉片的淀粉和己糖含量顯著高于早上取樣葉片，但晚上取樣葉片對Pst DC3000的抗性強于早上取樣葉片，表明葉片中的糖分特別是己糖并沒有被病菌吸收利用，而是更多的被植物用于抗病反應，例如用于合成SA和JA以及清除過量的活性氧(H2O2)。此外，高的己糖含量也可能通過信號途徑誘導植物的抗病反應。

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