不同麻醉方式對自發性高血壓大鼠腦出血凋亡基因表達水平的影響

趙廣平， 陳永學， 甄書青， 侯俊德， 劉 飛

(河北省邯鄲市中心醫院麻醉科， 河北 邯鄲 056001)

高血壓腦出血是高血壓人群常見疾病之一，其發病率和致殘率均較高，我國發病率約為17.1%～55.4%，現已成為我國第一大致殘因素和第三大致死疾病[1]。研究表明，腦出血后血腫周圍腦組織存在著逐漸加重的腦水腫和腦組織缺血半暗帶損傷區，及時有效的手術干預對于減少病死率和提高患者的生活質量具有積極意義[2]。隨著手術方式的不斷改進，近年來以神經內鏡技術為主的微創手術開始受到廣泛關注，全麻下行開顱顯微手術取得良好療效。靶控靜脈麻醉是一種通過調節作用藥物濃度控制麻醉深度的麻醉方式，能有效減少患者應激反應，減輕血流動力學影響[3]，但有關麻醉方式對腦出血病灶區腦組織神經細胞的研究仍鮮有報道。本研究旨在通過構建自發性高血壓大鼠腦出血模型，在動物模型上探究不同麻醉方式對腦出血大鼠神經細胞凋亡情況的影響，明確不同麻醉方式對腦出血病灶的直接影響，從而為指導臨床提供可靠參考。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1實驗動物:30只健康自發性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive rat，SHR)，雌雄各半，體重 250～300g，均于SPF級動物房中進行適應性飼養，室溫22～24 ℃，相對濕度50～60%，通風良好，環境安靜，期間自由飲水，自由攝食。實驗動物購于廣東省醫學實驗動物中心。所有動物實驗均經倫理委員會批準。

1.1.2主要試劑:Ⅶ型膠原酶(美國Sigma公司)；Trizol裂解液、BCA蛋白定量試劑盒(美國Invitrogen公司)；實時熒光定量逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒均(日本TaKaRa公司)；兔抗鼠β-actin單克隆抗體、鼠抗人Bcl-2體抗單克隆抗體、鼠抗人Bax體抗單克隆抗體、鼠抗人Caspase-3體抗單克隆抗體(美國Abcam公司)；Tunel試劑盒(美國Roche公司)；PBS磷酸鹽緩沖液、蛋白上樣緩沖液(中國上海碧云天生物工程研究所)。

1.2方 法

1.2.1動物分組與模型構建:所有動物適應性飼養一周后，術前12h禁食，4h禁水。所有實驗大鼠均采用大鼠自體血注入法建立腦出血模型[4]：大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上，根據圖譜定位大鼠右側尾殼核，于此處采用牙科制備直徑約1.5mm的圓孔，至硬腦膜表面。采用微量注射器抽取股動脈新鮮動脈血液50μL，經鉆孔垂直注入腦。分次退針，醫用骨蠟封閉，觀察無血液溢出后，縫合、包扎。模型構建成功后，將實驗大鼠隨機分成兩組，每組15只，分別麻醉A組和麻醉B組。采用3%戊巴比妥(65mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠生效后，給予氣管插管后機械通氣。麻醉A組大鼠術中分次經尾靜脈推注芬太尼+2.5%七氟烷維持麻醉；麻醉B組大鼠術后給予1.5ng/mL舒芬太尼+2.5μg/mL丙泊酚靶控靜脈持續輸注維持麻醉。分別于造模術后6h、12h、24h、48h、72h，每組隨機取3只大鼠處死取腦，去除低位腦干、前方嗅球和后方小腦，4%多聚甲醛固定待用。

1.2.2神經行為學評分:各組大鼠分別于術后6h、12h、24h、48h、72h進行Bederson's神經行為學評分[5]：以行為均正常記0分；以提鼠尾離地約1尺，手術對側前肢內旋、內收記1分；以推大鼠雙肩，手術對側抗力下降記2分；觀察大鼠在水平面行走情況，以圍繞健側轉圈記3分；以不能自主活動記4分。分數越高說明神經損傷越嚴重。

1.2.3腦組織含水量檢測:實驗動物取腦后，去除小腦及腦干，稱量濕重，將樣本置于80℃恒溫箱中干燥，48h后稱量樣本干重，根據公式：腦組織含水量(%)=(腦組織濕重-腦組織干重)/腦組織濕重×100%。

1.2.4TUNEL染色法檢測腦組織神經細胞凋亡:實驗動物腦組織4%多聚甲醛固定過夜后予以雙蒸水沖洗、脫水、脫酒精、氯仿透明后浸蠟、石蠟包埋后制成蠟塊，制備厚度為2～3μm切片，使用In Situ Cell Death Detection Kit進行TUNEL染色，滴加TUNEL反應液50 μL(Enzyme solution及Label Solution按1∶9配制，即用即配，冰上操作)，保濕、避光、37℃孵育60min；PBS漂洗后，滴加DAPI至完全覆蓋細胞以復染核；再次漂洗后，滴加抗熒光淬滅劑于載玻片上，將爬片倒扣在滴有抗熒光淬滅劑的載玻片上封片，于400×顯微鏡下觀察染色效果。

1.2.5免疫組化實驗檢測凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表達情況:取保存于多聚甲醛中的腦組織，采用脫水機進行自動脫水處理，隨后采用包埋機進行石蠟包埋處理，冰凍后制備連續切片，每片厚度約為2.0μm。將切片置于二甲苯及梯度酒精中依次浸泡脫蠟、脫水，使用PBS洗滌3次，于切片上滴加枸櫞酸鈉緩沖溶液。滴加10%山羊血清進行封閉處理，干燥后，滴加Bax、Bcl-2及Caspase-3單克隆抗體4℃孵育過夜。37℃孵育二抗1h，PBS洗滌3次，采用DAB化學發光劑顯影。自來水沖洗后，蘇木素復染30s。沖洗后將切片至于梯度酒精進行脫水處理。隨后置于梯度二甲苯溶液中進行透明處理。隨后使用中性樹脂覆蓋玻片進行封固。于光學顯微鏡下觀察并采集圖片，應用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件處理并作統計，觀察不同組別樣本中Bax、Bcl-2及Caspase-3等凋亡標志蛋白表達情況。

1.2.6RT-PCR實驗檢測凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達水平:腦組織細胞總RNA采用Trizol法，用紫外分光光度儀測定總RNA濃度與純度，A260/280在1.8～2.0。按照mRNA反轉錄試劑盒操作說明進行反轉錄，參照SYBR?Premix Ex Taq TM試劑盒說明進行RT-PCR檢測，反應程序：95℃ 2min，95℃ 15s，60℃ 30s，68℃ 60s，40個循環，最后95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s收集熒光信號，計算相對定量結果。所有試驗重復3次，相對定量分析按照2-[△△Ct(實驗組)-△△CT(對照組)]求出Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達水平。Bax、Bcl-2、Caspase-3引物及內參GAPDH印物均由上海捷瑞生物工程有限公司設計合成。

1.2.7Western Blot實驗檢測凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3 表達水平:大鼠腦組織每例約50mg，加入組織蛋白提取液，置于冰盒中，充分碾磨，10000r/min離心10min取上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒對提取的蛋白進行定量，根據標準曲線計算蛋白含量。各組以30～60μg相同的蛋白上樣量，煮沸變性后進行10% SDS-PAGE凝膠電泳。電泳完成后，使用半干轉儀轉移至PVDF膜，然后用5%脫脂牛奶封閉1h，使用抗Bax抗體(1∶1000)、抗Bcl-2抗體(1∶1000)、抗Caspase-3(1∶800)4℃孵育過夜。PBS-Tween20液漂洗，HRP標記的二抗反應，再次用PBS-Tween20液洗膜，ECL顯色，凝膠成像儀中曝光和拍照，檢測腦組織中Bax、Bcl-2及Caspase-3等凋亡標志蛋白表達情況。灰度值用Image Pro Plus 6.0軟件來測定。每組實驗重復3次。

1.3統計學處理:應用SPSS20.0統計軟件進行分析。采用Shapro-Wilk檢驗數據是否符合正態分布，采用Bartlett檢驗進行方差齊性檢驗。符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示，兩組數據間均數比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1不同麻醉大鼠術后神經行為學評分比較:兩組大鼠術后不同時點神經行為評分均明顯增高，與麻醉A組比較，麻醉B組大鼠在術后6h、12h、24h、48h、72h等同時點時神經行為評分明顯較低(P<0.05)，組間差異具有統計學意義。見表1、圖1。

圖1 不同麻醉大鼠術后神經行為學評分比較

表1 不同麻醉大鼠術后神經行為學評分比較

2.2不同麻醉大鼠術后腦組織含水量比較:兩組大鼠術后出現不同程度腦水腫，麻醉B組大鼠在術后6h、12h、24h、48h、72h時與同時點麻醉A組比較，腦組織含水量均明顯較低(P<0.05)，組間差異具有統計學意義。見表2、圖2。

表2 不同麻醉大鼠術后腦組織含水量比較

圖2 不同麻醉大鼠術后腦組織含水量比較

2.3不同麻醉大鼠腦組織細胞凋亡數比較:兩組大鼠術后腦組織樣本均可見TUNEL陽性表達細胞，陽性表達主要集中于神經元胞核，呈點狀或團狀深棕色顆粒。兩組大鼠術后6h、12h、24h、48h、72h時細胞凋亡數均呈現增加趨勢，且麻醉A組大鼠術后6h、12h、24h、48h、72h時細胞凋亡數均明顯高于同時點麻醉B組大鼠(P<0.05)，組間差異具有統計學意義。見圖3。

圖3 不同麻醉大鼠腦組織細胞凋亡數比較(×40)

2.4不同麻醉大鼠腦組織凋亡相關蛋白陽性表達情況比較:免疫組化實驗結果顯示，不同麻醉方式干預后，隨著時間點的延長，Bax、Bcl-2及Caspase-3等凋亡相關蛋白表達水平均明顯升高，與麻醉A組比較，同時點麻醉B組在腦出血術后6h、12h、24h、48h、72h各時點Bax及Caspase-3蛋白表達水平均明顯較低(P<0.05)，且麻醉B組在術后6h、12h、24h、48h、72h各時點Bcl-2蛋白表達水平則明顯高于同時點麻醉A組(P<0.05)，組間差異具有統計學意義。見圖4。

圖4 不同麻醉大鼠腦組織凋亡相關蛋白陽性表達情況比較(×40)

2.5不同麻醉大鼠腦組織凋亡相關蛋白mRNA表達情況比較:麻醉干預后即刻，麻醉A組大鼠腦組織中Bax及Caspase-3等促凋亡蛋白mRNA表達水平明顯高于麻醉B組(P<0.05)，麻醉A組大鼠腦組織中凋亡抑制蛋白Bcl-2 mRNA表達水平則明顯低于麻醉B組水平(P<0.05)，組間差異具有統計學意義。見圖5。

2.6不同麻醉大鼠腦組織凋亡相關蛋白表達情況比較:麻醉干預后與麻醉B組比較，麻醉A組大鼠腦組織中Bax及Caspase-3等促凋亡蛋白表達水平明顯較高(P<0.05)，其腦組織樣本中凋亡抑制蛋白Bcl-2表達水平則明顯低于麻醉B組水平(P<0.05)，組間差異具有統計學意義。見圖6。

3 討 論

靜脈吸入復合麻醉是指患者同時或先后實施靜脈全身麻醉和靜脈吸入麻醉的一種麻醉方式，具有麻醉起效快、術中易控制、麻醉維持穩定等優點，但在術后應激反應、認知功能障礙、術后不良反應方面具有一定的局限性[6,7]。靶控靜脈麻醉是一種通過調節目標藥物濃度控制麻醉深度的麻醉方式，具有麻醉深度易于控制、術后認知功能影響小、術后不良反應少、患者應激反應小等明顯優勢[8,9]。既往腦出血相關麻醉方式及藥物研究主要在大體標本水平進行療效評估，在分子及基因水平方面研究鮮有報道。由此本研究提出科學問題：不同麻醉方式對腦出血病灶區細胞凋亡情況是否具有影響。

自發性高血壓大鼠是目前國內公認的最接近人類高血壓的動物模型[10]。本研究選取自發性高血壓大鼠作為動物模型，為控制腦出血病灶的部位和出血量大小，采用腦組織內直接注入自體血的方法構建腦出血動物模型。該方法是最常用的腦出血動物模型構建法，形成的血腫形態大小較穩定，同時還可模擬血液成份對自身腦組織的損傷作用，適用于研究腦出血后腦水腫改變及機體神經功能改變情況。根據麻醉方式不同，實驗大鼠分為采用靜脈吸入復合麻醉的麻醉A組和采用丙泊酚復合舒芬太尼靶控靜脈麻醉的麻醉B組。實驗結果顯示，腦出血模型大鼠在麻醉后6h即開始出現不同程度神經行為學改變及腦水腫改變，且隨著時間點的延長，模型大鼠神經行為學評分明顯增加，腦組織含水量也明顯增加，與麻醉A組比較，麻醉B組大鼠在術后不同時點神經行為學評分及缺血區腦組織含水量均明顯較低(P<0.05)，提示靶控靜脈麻醉能在一定程度上減少腦出血大鼠腦組織含水量，并減輕神經行為學評分。進一步的細胞凋亡能力實驗結果顯示，與麻醉A組大鼠比較，麻醉B組在各時點凋亡細胞數均明顯較低(P<0.05)，麻醉B組大鼠腦出血病灶區腦組織神經細胞中凋亡相關蛋白Bax及Caspase-3表達水平均明顯低于同時點麻醉A中組(P<0.05)，凋亡抑制蛋白Bcl-2水平則明顯高于同時點麻醉A中組(P<0.05)，說明靶控靜脈麻醉可減少腦出血后神經細胞中凋亡相關蛋白表達，從而減少神經細胞凋亡，猜測與舒芬太尼半衰期短、血腦屏障分散快、清除率高等因素有關，提示在麻醉過程中始終處于動態管理狀態的靶控靜脈麻醉能更好的為實驗動物提供補償，降低神經細胞凋亡及損傷。

綜上所述，丙泊酚復合舒芬太尼靶控靜脈麻醉有效控制麻醉深度及藥物作用濃度，減少腦組織神經細胞凋亡相關蛋白表達，減輕腦出血及腦組織水腫程度，改善神經行為學評分，對于保障手術患者的神經功能具有積極意義。