外周血Tim-3表達水平與食管癌放化療敏感性的相關性研究

趙春燕， 唐嘉迎

(重慶市大足區人民醫院, 重慶 大足區 402360)

食管癌(EC)是嚴重的消化道惡性腫瘤，居全球常見癌癥第八位，也是癌癥導致死亡的第六大病因，而我國EC高發，發病和死亡人數約占全球的50%，EC早期發病癥狀不明顯，多數患者確診時已錯過最佳治療時期[1]。目前，外科手術治療EC效果仍不能令人滿意，且只有30%～40%的患者可以接受手術[2]。不論EC患者出于何種原因不能采用手術治療，局部放化療無疑為其提供最佳選擇，但研究表明，不同患者對放療和化療敏感性不同，該手段治療患者的5年生存率僅為26%，復發率高，缺乏有效的預后生物標志物是食管癌高死亡率的原因[3]。黏蛋白3(Tim-3)是T細胞免疫球蛋白黏蛋白家族中重要成員，Tim-3不僅介導T細胞相關免疫應答，在多種癌癥組織中均能被檢測到，與腫瘤的免疫逃逸、侵襲轉移有關，已在抗腫瘤領域得到廣泛應用[4]。為探討Tim-3與EC放化療敏感性的相關性，本研究通過檢測并分析Tim-3在EC患者腫瘤組織及外周血Tim-3表達情況，以期找到影響EC放化療敏感性新的標志物。

1 資料與方法

1.1一般資料:選擇2017年1月至2019年12月期間就診我院的首次確診EC的患者為研究對象，收集其病理標本及病理資料。入選標準：①按照國際抗癌聯盟的TNM分期標準(第七版)進行EC分期[5]，符合Ⅲ、Ⅳ期標準；②EC首診患者，未出現食管穿孔；③對放療和化療均能耐受；④無其他功能器官障礙。排除標準：①患有其他惡性腫瘤者；②既往接受過手術、放療或化療者；③并發嚴重代謝類疾病者。④不能按照方案要求配合研究者。共有78例EC患者符合要求，分為TNM Ⅲ期49例和Ⅳ期29例，其中47例為男性患者，其他31例為女性，平均年齡(66.47±16.38)歲。

1.2治療方法:參照《食管癌規范化診療指南(2013年版)》并結合患者情況，對納入的患者采用同步放化療方法進行治療[6]。化療方案：采用PF方案，按500mg/m2劑量靜滴5-氟尿嘧啶，第1～5天；按40mg/m2靜滴順鉑，第1天。共需治療2個療程，每個療程28d。放療方案：采用(3DCRT/IMRT)常規分割方案，每日進行一次，單次劑量為1.8～2.0Gy，一周5次，總劑量為46Gy。放療第1天給予第一周期化療，直至第28天評估患者放療反應后給予第二周期化療。同時放化療結束間隔1個月，復查食管鋇餐造影和胸腹部CT，根據復查結果評價近期療效。根據患者情況，繼續鞏固3～4個周期化療后進行復查和隨訪，評估治療效果。

1.3療效評估及分組[6]:參照實體瘤療效標準評估近期治療效果，評估內容見表1。根據治療有效情況將所有患者分為放化療敏感組和抗拒組，療效評估為CR和PR患者納入為敏感組，SD和PD患者則納入為抗拒組。

表1 療效評估標準

1.4免疫組化法檢測Tim-3

1.4.1標本檢測[7]:采用免疫組化法分析EC患者的Tim-3在EC組織和癌旁組織表達情況。方法：將癌旁和癌癥組織的蠟塊制成石蠟切片，厚度為4μm，60℃條件下加熱切片后，對石蠟切片進行脫蠟脫苯處理，之后用過氧化氫溶液浸泡15min，以使內源性過氧化物酶失活；用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每次3min，但不能直接沖刷組織；之后采用pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液浸泡修復抗原；再次重復PBS洗滌步驟，室溫條件下染色處理約2h；用PBS再次洗滌，將通用型二抗滴在切片上，于室溫條件孵育15min左右，用PBS再次洗滌；所有切片在室溫下用DAB顯色液處理約5min，再次用PBS洗滌后，用蘇木精及伊紅進行復染；最后脫水處理，封片，顯微鏡閱片并拍照。

1.4.2結果判定[7]:每張切片以細胞染色強度及染色比例作為評分標準，并由至少2名病理學領域專家進行評分。①染色強度評分標準：無染色為0分，弱染色為1分，中等染色為2分，強染色為3分。②癌細胞染色比例評分標準：染色≤5%為0分，>5%且≤25%為1分，>25%且≤50%為2分，>50%且≤75%為3分，>75%為4分。最后以染色強度評分和比例評分的乘積進行綜合評價，分數介于0～12分，0～3分則判定為低表達，4～12分則為高表達。

1.5外周血Tim-3表達水平測定[8]:清晨空腹采集患者外周血5mL，經稀釋后，采用Ficol-Hypaque密度離心法分離外周血單核細胞(PBMCs)，3000轉/分離心力離心20min后，吸取上清液中白膜層，加入含有PBS的離心管中混勻，再以2000轉/分離心10min，去上清液即得PBMCs。取3MIU PBMCs加入流式CD16、CD56和Tim-3以及單標和同型對照標志物，取4%多聚甲醛溶液500μL固定后上機檢測，所用儀器為FACS Calibur流式細胞儀(美國Becton Dickinson 公司)。

1.6統計分析:使用SPSS25.0進行統計分析，計量資料以均數±標準差方式表示，采用t檢驗進行比較；組間計數資料應用卡方(χ2)檢驗進行分析。應用Kaplan-Meier生存曲線分析Tim-3蛋白表達與EC患者預后的關系；采用COX回歸考察影響EC預后的危險因素；繪制Tim-3對EC預后的ROC曲線，并計算曲線下面積(AUC)。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1兩組患者病理資料比較:經同步放化療后，36例EC患者緩解，納入為敏感組，42例患者治療效果不理想，納入為抗拒組。經比較，敏感組的外周血Tim-3水平顯著低于抗拒組(P<0.05)，兩組患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移情況及TNM分期均不具有顯著差異(P>0.05)。結果見表2。

表2 兩組患者病理資料比較

2.2Tim-3蛋白表達情況:Tim-3蛋白在癌旁組織和EC組織中都有表達，主要表達于細胞膜和細胞質中，著色情況見圖1。但Tim-3在EC組織中高表達為67例(85.90%)，而癌旁組織中輕度表達為8例(10.26%)，二者具有統計學差異(P<0.05)，詳見表3。

表3 Tim-3蛋白表達情況n(%)

圖1 Tim-3的免疫組化結果(×20)，A.癌旁組織;B.EC組織

2.3EC患者Tim-3與病理參數的關系:EC組織中Tim-3的異常表達在浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期具有顯著差異(P<0.05)，而Tim-3的表達與性別和年齡無明顯關系，且對腫瘤大小及其分化程度亦無顯著影響(P>0.05)，結果見表4。

表4 EC患者Tim-3與病理參數的關系

2.4Tim-3與EC患者預后的關系:Kaplan-Meier生存曲線進一步評估Tim-3蛋白表達與EC患者總生存時間(OS)及無病生存時間(DFS)的關系。結果可知，高表達的Tim-3的患者具有更低的OS及DFS(P<0.05)。結果見圖2。

圖2 Tim-3與EC患者預后的關系

2.5COX回歸分析:以EC患者的放化療敏感性為因變量，自變量包括外周血Tim-3水平(高表達=1，低表達=0)、浸潤深度(高浸潤=0，低浸潤=1)、淋巴結轉移(是=0，否=1)及TNM分期(Ⅲ期=0，Ⅳ期=1)，進行COX回歸分析，結果Tim-3高表達(HR=4.253，95%CI 1.464～12.353)是影響EC患者放化療敏感性的獨立危險因素。結果見表5。

表5 COX回歸分析

2.6外周血Tim-3水平與EC放化療敏感性的ROC曲線:為進一步確定外周血Tim-3水平與EC患者放化療的敏感性，以放化療敏感賦值為1，放化療抗拒賦值為0，以7.20ng/mL作為預測的臨界值，繪制ROC曲線。結果ROC曲線下面積為0.848，預測的靈敏度為86.2%，特異度為76.3%。詳見圖3。

圖3 外周血Tim-3水平與EC放化療敏感性的ROC曲線

3 討 論

EC早期發現是可以根治的，盡管醫學專家做了很多努力，但限于目前診療技術，仍有90%確診患者為中晚期，5年生存率低于20%[9]。因此，當前任務是有效提高中晚期EC患者的治療效果。近年來興起的新輔助放化療(NCRT)聯合手術已逐漸成為局部進展期EC的標準治療模式，但不同患者表現出放化療敏感性迥異，EC復發率及預后效果仍有待改善[3]。近年來，隨著蛋白質組學技術快速發展，為EC早期診斷、預后預測提供更多可能，有望從中找到預測EC放化療敏感性的潛在標志物[10]。

Tim-3是一種負調節性免疫蛋白，在不同類型的免疫細胞中均有表達，包括T細胞、調節性T細胞(Tregs)、巨噬細胞、自然殺傷(NK)細胞和肥大細胞，在食管癌、胃癌、肺癌等腫瘤細胞上也有發現，已廣泛應用于惡性腫瘤治療領域。研究表明[11]，Tim-3蛋白主要表達于EC組織，陽性率高達80%以上，而癌旁組織明顯更低，認為Tim-3表達水平可能與EC患者的預后有關，但有關Tim-3與EC相關性的報道較少，其結論有待驗證。而本研究通過免疫組化法測定Tim-3蛋白表達情況，發現Tim-3蛋白在癌旁組織和EC組織中都有表達，主要表達于細胞膜和細胞質中。但Tim-3在EC組織中高表達為85.90%，而癌旁組織中輕度表達為10.26%，差異具有統計學意義(P<0.05)；另外，通過對比不同Tim-3表達水平患者的病理參數發現，TNM分期、腫瘤浸潤深度及淋巴結轉移3個參數表現出明顯差異(P<0.05)，且Tim-3蛋白異常高表達患者OS及DFS明顯縮短，提示Tim-3可能通過高表達影響腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移及癌癥進展，導致疾病惡化，這與既往研究[11]結論基本一致，Tim-3可能與微環境中CD8+、PD-1+及T細胞作用促進腫瘤浸潤，其可以在食管癌患者T細胞表面表達，從引起T細胞功能疲乏，發揮免疫抑制作用，并且可誘導淋巴結轉移，導致疾病進展惡化，TNM分期升高。

腫瘤細胞依賴腫瘤微環境而生存，在這環境中還存在跟腫瘤相關的巨噬細胞、髓源抑制性細胞(MDSCs)等，對機體發揮著免疫抑制作用，加重腫瘤的浸潤[12]。而楊惠雲等[13]通過檢測腫瘤組織及外周血來源的Tim-3表達水平發現，Tim-3可通過與MDSCs配體結合，增加MDSCs的免疫抑制功能。喻雪琴等[9]也發現，外周血PBMCs表面Tim-3高表達可能會降低免疫細胞的免疫狀態，誘發免疫耐受，從而使疾病發展走向慢性。本研究發現，放化療抗拒患者的外周血Tim-3水平明顯高于敏感組患者(P<0.05)，提示Tim-3可能在EC患者放化療敏感性研究中發揮作用，但相關研究較少，其作用機制可能與MDSCs協同作用介導的免疫逃逸有關。另外，Tim-3還可能通過以下機制介導腫瘤免疫抑制：①與微環境中CD8+、PD-1+及T細胞作用促進腫瘤浸潤，具有顯著的耗竭特征；②在DC細胞上表達，抑制因腫瘤DNA誘導的機體損傷恢復模式的激活；③在腫瘤細胞上表達，可以促進MDSCs分化增值，從而抑制腫瘤免疫。但關于外周血Tim-3表達與EC放化療敏感性研究很少，有待進一步研究證實其作用機制。

癌癥作用機理復雜，EC的影響因素很多，與地域、年齡、外部環境等有關系。而本文COX回歸分析顯示，外周血Tim-3高表達(HR=4.253，95%CI 1.464-12.353)是影響EC患者放化療敏感性的獨立危險因素。但可能因樣本選取及病例數相對較少的問題，未能發現其他顯著影響EC患者放化療敏感性的因素。為進一步確定外周血Tim-3水平與EC患者放化療的敏感性，通過繪制ROC曲線，結果Tim-3的臨界值為7.20ng/mL，ROC曲線下面積為0.848，預測的靈敏度為超過85%，特異度也超過75%，說明外周血Tim-3與EC放化療敏感性具有較強相關性。

由此可知，放化療抗拒EC患者癌癥組織及外周血Tim-3蛋白高表達，與EC病理參數及預后密切相關，且外周血Tim-3與EC放化療敏感性存在一定的相關性，提示Tim-3可作為EC預測的敏感標志物。但EC作用機制復雜，尚未明確Tim-3對EC的作用機制，仍有待后續加大樣本量更加深入的研究。