腦膜瘤組織中脆性X相關基因1過表達促進腦膜瘤細胞生長與血管生成的研究

曹 杰， 張 杰， 孟發財， 藺鵬幀， 袁云超， 黃衛東，侯明山， 王繼軍， 繆星宇， 師 蔚， 李 民

(1.陜西省人民醫院神經外科， 陜西 西安 710004 2.西安交通大學第二附屬醫院神經外科， 陜西 西安 710004)

腦膜瘤(Meningiomas)是最常見的腦內和其他中樞神經系統腫瘤類型，約占所有顱內腫瘤的30%，源自腦膜內皮細胞[1]。根據2016年世界衛生組織(WHO)的分類，腦膜瘤被分類為Ⅰ級、Ⅱ級和Ⅲ級，Ⅰ級腦膜瘤是典型或良性的腫瘤，約占所有腦膜瘤的88～94%。非典型腦膜瘤屬于Ⅱ級，約占腦膜瘤的5%～8%，切除后復發率為29%～52%，而且Ⅱ級表現為惡性進展趨勢，腫瘤細胞遷移和周圍組織浸潤明顯增加。間變性變體(Ⅲ級)極為罕見，占所有腦膜瘤的1%～3%，中位總生存期僅為1.5年。腦膜瘤的標準治療方法是手術切除，但復發的可能性極大。由于逆作用和多重耐藥性，化學治療藥物的效率也會隨著時間的延長而降低[2]。研究表明，腦膜瘤復發的風險與腫瘤的分子特征密切相關，確定新的靶標以促進早期診斷對提高腦膜瘤患者至關重要。脆性X相關蛋白1(fragile X-related protein 1，FXR1)是一種RNA結合蛋白，為脆性 X智力遲鈍相關基因家族中的一員，主要分布于神經系統及肌肉組織[3]。FXR1作為RNA誘導的沉默復合體(RISC)的成員，FXR1蛋白能夠與RNA結合，因此與基因翻譯和沉默密切相關[4]。FXR1對正常的肌發生和肌肉發育至關重要，最近研究表明，FXR1表達與幾種人類癌癥包括乳腺癌、卵巢癌、頭頸癌和非小細胞肺癌的不良預后相關[5,6]。然而FXR1對于腦膜瘤的影響研究尚未見報道。本研究觀察FXR1在腦膜瘤組織中的表達情況及對腦膜瘤細胞生長和血管生成的影響，旨在為腦膜瘤的靶向治療方案的提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1臨床資料：選取我院自2016年6月至2019年10月收治腦膜瘤患者的組織標本為研究對象，包括腫瘤組織標本及對應瘤旁組織標本各24例。所有患者均行Simpson分級Ⅰ或Ⅱ級腫瘤切除術，完整切除腫塊和累及的硬腦膜組織，再切除周圍擴大約2cm硬腦膜及附著的正常腦膜組織，經顱腦核磁共振成像與術后病理診斷均證實為腦膜瘤。患者中有13例男性，11例女性，年齡在42～69歲，平均年齡(52.31±4.79)歲。根據世界衛生組織(WHO)分級，良性腦膜瘤(Ⅰ級)18例，非典型性腦膜瘤(Ⅱ級)6例。納入標準：患者術前未進行任何治療，均具有完整的病例資料，經CT證實存在顱內血腫，既往無顱內腫瘤病史。患者組織標本的使用取得患者及家屬的知悉并簽署知情同意書。

1.2主要試驗材料與試劑:人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)購自上海中科院典型培養物保藏中心，FXR1免疫組織化學染色試劑購自北京天根生化公司，MEM培養基、胎牛血清(FBS)購自美國HyClone公司，Lipofectamine 2000試劑盒購自美國Invitrogen公司，RNAiso Plus試劑、反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，CCK-8試劑盒購自美國Sigma公司，結晶紫、Matrigel基質膠及BCA試劑盒購自上海碧云天生物技術公司，ECL發光液與聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自武漢博士德生物公司，抗體FXR1、VEGF、EDN-1與辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔IgG購自美國Santa Cruz公司，抗體CD31、CD34購自美國eBioscience公司。pcDNA3.1-FXR1質粒載體和引物均有上海生工生物公司設計構建與合成。

1.3方 法

1.3.1免疫組織化學染色:將腦膜瘤組織固定于4%多聚甲醛，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋，切成厚度為4μm連續切片。脫蠟脫水后，加入枸櫞酸緩沖液煮沸10min進行抗原修復，冷卻后采用PBS清洗，置于3%H2O2溶液消除內源性過氧化物酶，PBS清洗，滴加山羊血清封閉液，在室溫下封閉30min，滴加稀釋的一抗工作液(1∶200)，4℃下孵育過夜。次日，緩沖液清洗后，滴加稀釋的HRP標記的二抗(1∶1000)，室溫孵育30min，PBS再次沖洗后，滴加二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染15s，反復沖洗，脫水透明后，中性樹膠封片，干燥后電鏡下觀察并拍照。FXR1的陽性表達以棕黃色顆粒為主，電鏡下隨機選擇5個視野，以陽性腫瘤細胞數及染色強度進行綜合評定。陽性細胞評分:陽性細胞比例<5%記0分，5%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，>75%記4分。染色強度評分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩者相加分數小于2分則判定為陰性，大于等于2分判定為陽性。

1.3.2腦膜瘤細胞分離、培養:在無菌條件下將腦膜瘤組織剪碎，加入含1g/L膠原酶的MEM培養液，在5% CO2、37℃細胞培養箱內孵育4h，然后采用300μm篩網過濾，收集濾液，離心機中以2000r/min離心20min，在沉淀中加入含100mL/L FBS的 MEM培養液繼續培養，當細胞基本長滿瓶底壁為單層時，融合度為80%左右時，使用0.25%胰蛋白酶消化離心。

1.3.3細胞轉染:取生長狀態良好的腦膜瘤細胞，調整密度為1×105個/孔接種于6孔板，待細胞生長密度約為80%時，分為三組，包括空白對照組、陰性對照組(pcDNA3.1-NC組)和過表達FXR1組(pcDNA3.1-FXR1組)，按照Lipofectamine 2000脂質體轉染法進行轉染，具體按照試劑盒說明書操作，分別將構建好的pcDNA3.1-FXR1質粒載體與pcDNA3.1空質粒載體轉染至pcDNA3.1-FXR1組及pcDNA3.1-NC組的腦膜瘤細胞中，于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養4 h 后更換新鮮培養基，繼續培養48h后收集細胞，供后續實驗使用，設置空白對照組為正常培養、不進行轉染的腦膜瘤細胞。

1.3.4實時熒光定量PCR:根據RNAiso Plus試劑說明提取各組腦膜瘤細胞的總RNA，采用NanoDrop2000 紫外分光光度計檢測 RNA 的純度及濃度。逆轉錄試劑盒進行反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，參照SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒說明進行qRT-PCR實驗，檢測細胞中FXR1基因mRNA的表達情況，以GAPDH作為內參。擴增條件為：95℃ 5 min，1個循環；95℃ 30 s、60℃ 30 s、58℃ 30 s，40個循環。實驗重復 3 次。結果采用2-ΔΔCt法計算各基因的表達水平。采用Primer Premier5軟件設計基因引物序列，引物序列：FXR1上游引物5’-TCGATCTTTACCCATCCTTCCT-3’，下游引物5’- ATCGATATGGAGGACATGACGGTGG-3’；GAPDH上游引物5’-GGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3’，下游引物5’- AGATGGTGATGGGCTGCCC-3’。

1.3.5Western blot:在各處理組腦膜瘤細胞中加入預冷的RIPA 裂解液進行裂解，離心取上清液，BCA試劑盒說明測定蛋白濃度。取25 μg總蛋白上樣，通過10%SDS-PAGE分離，并將分離蛋白轉移至PVDF膜上。TBST 洗滌3 次，5%山羊血清進行封閉2h，洗滌并加入稀釋的一抗FXR1(1∶1000)、VEGF(1∶1000)、EDN-1(1∶1000)，在4度C下孵育過夜。次日，TBST洗膜3次，加入稀釋的HRP標記山羊抗兔IgG(1∶5000)為二抗，室溫下孵育2h。再次TBST洗滌3次，滴加ECL發光液進行顯影，采用Image J圖像分析軟件統計各條帶灰度值，以GAPDH為內參計算各蛋白相對表達量。

1.3.6CCK-8檢測:將腦膜瘤細胞以1×104個/孔接種于96孔板，置于37℃、5% CO2細胞培養箱中過夜培養，按照1.3.3進行細胞轉染，每孔設置3個復孔，分別于轉染后24h、48h、72h和96h，每孔加入10μL CCK-8試劑液，混合均勻后，繼續培養4h，采用全自動酶標儀在450nm處檢測各孔細胞的光密度(OD)值。

1.3.7細胞克隆形成實驗:收集轉染后的腦膜瘤細胞，稀釋并以4×103個接種到培養皿中，接種后輕晃使細胞均勻分布，14d，出現細胞集落并用PBS洗滌，加4%多聚甲醛固定菌落，用0.5%結晶紫染色15min，使用流水沖洗，自然條件下干燥，在光鏡下觀察并計數細胞集落數目(將≥50個細胞克隆團為1個集落)。

1.3.8流式細胞術:收集轉染后的腦膜瘤細胞，使用0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA處理細胞，以4,000r/min離心5min，采用PBS重懸細胞，滴加4%多聚甲醛，37℃處理10min，置于冰上處理1min。然后加入90%甲醛，繼續在冰上靜置30min。PBS清洗細胞，離心并重懸細胞，室溫封閉10min，加入抗體CD34與CD31，室溫孵育30min，PBS清洗細胞，離心、重懸，采用流式細胞儀檢測，FlowJo軟件進行分析。

1.3.9體外小管生成試驗:基質膠置于并上融化，取100μL緩沖液與900μL BD Matrigel基質膠混合均勻進行稀釋，將150μL稀釋的基質膠加入24孔板中，置于37℃孵育1h，待膠凝固。對HUVECs細胞進行轉染實驗，將轉染后的細胞濃度調整為5×105個/mL，取1mL接種于預先鋪好的基質膠的孔中，繼續培養12h，在倒置顯微鏡下觀察小管形成情況并拍照。

2 結 果

2.1腦膜瘤組織及瘤旁組織中FXR1表達比較:免疫組織化學染色檢測腦膜瘤組織與瘤旁組織中FXR1表達，結果如圖1所示。經過統計發現，腦膜瘤組織中FXR1陽性表達大于瘤旁組織標本，差異均有統計學意義(P<0.05)。腦膜瘤組織中FXR1陽性表達為19例(79.17%)，其中Ⅰ級為13例(86.67%)，Ⅱ級為6例(100%)，而瘤旁組織中FXR1陽性表達為3例(12.5%)。

圖1 免疫組化染色檢測FXR1表達(×100)

2.2轉染后腦膜瘤細胞FXR1表達檢測:qRT-PCR和Western Blot檢測結果如表1與圖2所示，與空白對照組和pcDNA3.1-NC組比較，pcDNA3.1-FXR1組細胞中FXR1 mRNA相對表達量和蛋白表達量均顯著升高(P<0.05)，表明細胞轉染成功。

表1 各組腦膜瘤細胞中FXR1 mRNA相對表達量和蛋白表達量比較

圖2 Western Blot檢測腦膜瘤細胞中FXR1蛋白表達

2.3過表達FXR1促進腦膜瘤細胞增殖活性:CCK-8法檢測結果如圖3所示，轉染48、72、96h后，與空白對照組和pcDNA3.1-NC組比較，pcDNA3.1-FXR1組腦膜瘤細胞的增殖活性顯著升高(P<0.05)，而陰性對照組與空白對照組各時間點的增殖活性之間差異無統計學意義(P>0.05)。

圖3 CCK-8法檢測各時間點腦膜瘤細胞增殖活性

2.4過表達FXR1促進腦膜瘤細胞克隆形成:細胞克隆形成實驗檢測結果見圖4，與空白對照組和pcDNA3.1-NC組比較，pcDNA3.1-FXR1組腦膜瘤細胞克隆形成數目顯著增加(P<0.05)；而與空白對照組比較，pcDNA3.1-NC組細胞克隆數目無顯著變化(P>0.05)。

圖4 細胞克隆形成實驗檢測腦膜瘤細胞克隆形成能力

2.5過表達FXR1促進VEGF、EDN-1蛋白表達:Western Blot檢測結果如圖5，與空白對照組和pcDNA3.1-NC組比較，pcDNA3.1-FXR1組腦膜瘤細胞中VEGF、EDN-1蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)；空白對照組與pcDNA3.1-NC組細胞中VEGF、EDN-1蛋白表達水平間無顯著變化(P>0.05)。

圖5 Western Blot檢測腦膜瘤細胞中VEGF、EDN-1蛋白表達

2.6過表達FXR1增加CD34+/CD31+陽性細胞表達:流式細胞術篩選結果如圖6所示，空白對照組和pcDNA3.1-NC組細胞組間CD34+/CD31+陽性細胞數無統計學差異(P>0.05)；而與空白對照組和pcDNA3.1-NC組比較，pcDNA3.1-FXR1組CD34+/CD31+陽性細胞數顯著增多(P<0.05)。

圖6 流式細胞術檢測CD34+/CD31+陽性細胞表達

2.7過表達FXR1促進HUVECs體外小管生成:體外小管生成試驗結果如圖7所示，空白對照組與pcDNA3.1-NC組的管腔形成數目較少；與空白對照組和pcDNA3.1-NC組比較，pcDNA3.1-FXR1組的管腔形成數目明顯增多，管腔較大。

圖7 小管生成試驗檢測各組HUVECs細胞的小管生成

3 討 論

近年來，由于基因組和表觀遺傳學在腫瘤研究分析中的應用，為腦膜瘤的分子診斷和治療提供了更為全面的信息[7]。但是，仍需準確尋找腦膜瘤相關特異性基因與診治及預后之間的相關性并進行更詳細的研究，以建立更加全面可靠的綜合診治策略。目前，關于腦膜瘤的腫瘤標志物的報道也不斷增加，從分子層面對驅動腦膜瘤發生和發展的因素進行深入探討對腫瘤的診治意義重大。FXR1作為基序結合RNA并在真核生物中發揮功能，對于RNA運輸、翻譯及穩定性具有一定的作用[4]。FXR1包含兩個區域，富含精氨酸和甘氨酸，能夠形成RGG結構域且可以識別G-quartet結構域并與之發生特異性結合，G-quartet是DNA和RNA的二級結構，在四個配位的鳥嘌呤之間形成。人體中FXR1基因編碼一種蛋白質，并以至少7種亞型表達[8]。然而，FXR1在人類疾病中的作用研究相對較少，以往研究表明，FXR1在兒童腎癌中最常見的威爾姆斯腫瘤中表達上調[9]，抑制FXR1基因的表達可抑制卵巢癌細胞的生長及細胞增殖[10]，這些結果提示FXR1的調節功能可能與細胞癌變有關。本研究通過檢測人腦膜瘤組織及癌旁組織中FXR1表達后發現，FXR1在人腦膜瘤組織中也呈高表達，與之前在其他腫瘤疾病中的檢測結果一致。

腦膜瘤是高度血管性腫瘤疾病，因此，探究腦膜瘤中抑制血管生成可預防癌癥向惡性轉化。細胞因子血管內皮生長因子(VEGF)作為一種血管通透性因子，通過促進內皮細胞的遷移、增殖和管形成來充當血管新生的正調節劑。VEGF在腦膜瘤中上調，其作為促血管生成因子來發揮作用[11]。內皮素(EDN-1)由血管內皮細胞產生，參與許多生理病理過程的調節，例如心血管發育、肺動脈高壓以及神經細胞增殖、分化和遷移等[12]。本研究通過檢測過表達FXR1腦膜瘤細胞中VEGF和EDN-1的蛋白表達水平發現，該細胞中VEGF和EDN-1的蛋白表達水平均明顯增加。腫瘤血管生成主要是根據微血管密度(MVD)進行評估的，也可以使用各種內皮標記物如CD34和CD31進行測量，通過進一步研究FXR1對于腦膜瘤細胞血管生成的影響發現，過表達FXR1可使腦膜瘤中CD34和CD31標記的陽性細胞數量增多，此外，顯微鏡下也觀察到小管形成明顯變多，這些結果意味著FXR1可能會促進腦膜瘤細胞向血管內皮細胞分化，促進了腦膜瘤細胞的血管形成能力，加快腫瘤的轉移過程。

惡性腫瘤細胞的生長和轉移對于腫瘤的發生發展以及進一步惡化至關重要。腦膜瘤生長迅速，會頻繁復發或發生腦部侵襲，使其治療更具挑戰性。在這些情況下，采取有效措施抑制腫瘤細胞的生長與轉移是腦膜瘤的治療的關鍵一步。本研究結果顯示，過表達FXR1的腦膜瘤細胞的細胞增殖活性升高，同時細胞的克隆形成數目也明顯增加。由此推測，FXR1的表達增加促進了腦膜瘤細胞的生長，起到了促進腫瘤發展的作用。

綜上所述，本研究揭示了FXR1在腦膜瘤組織中呈現高表達狀態，并從微觀的角度探討了FXR1對腦膜瘤細胞生長和血管生成的影響，表明過表達FXR1能夠促進腦膜瘤細胞生長和血管生成，但此過程涉及的具體的作用機制以及分子表達模式關聯性有待進一步深入研究。