T細胞免疫球蛋白與黏蛋白結構域蛋白-3對2型糖尿病患者T細胞的影響

顧胤燁，張 玨，石 磊

(上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院檢驗科， 上海 201203)

患者長期罹患慢性炎癥，眾多的炎癥因子對胰島B細胞的損傷，誘發(fā)胰島素抵抗是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)發(fā)生的一個重要機制[1,2]。有研究[3]指出，炎癥最主要的損傷是累及人體先天免疫功能，通過先天性免疫細胞釋放炎癥因子進一步誘發(fā)胰島素抵抗，最終形成糖尿病。 但是，越來越多的學者認為，免疫因素調(diào)節(jié)在 2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要的作用[4]。 T細胞免疫球蛋白以及黏蛋白結構域蛋白-3(T cell immunoglobulin and mucin domain protein-3，TIM-3)屬于表達重要的免疫細胞因子，主要表達于免疫細胞表面，在感染性疾病患者以及腫瘤患者中可以通過影響T細胞功能而進一步起到免疫耐受的作用[5]。但是 T細胞免疫球蛋白以及黏蛋白結構域蛋白-3在 2型糖尿病患者中的表達和具體的調(diào)控作用的研究較少。本研究通過探討T細胞免疫球蛋白以及黏蛋白結構域蛋白-3在 2型糖尿病患者中的表達和對CD4+和CD8+T細胞功能的影響，為兩種蛋白對 2型糖尿病患者T細胞功能的具體作用機制的闡述提供科學基礎。

1 資料與方法

1.1一般資料:本研究選取2017年1月至2019年12月在本院的內(nèi)分泌科就診的72例2型糖尿病患者作為糖尿病組，其中男38例，女34例，平均年齡(60.3±9.7)歲，體質(zhì)量指數(shù)(23.7±3.1)kg/m2。并將糖尿病組患者分為亞組，經(jīng)抗體刺激組36例和無抗體刺激組36例，經(jīng)抗體刺激組男21例，女15例，平均年齡(61.4±8.5)歲，體質(zhì)量指數(shù)(23.9±3.3)kg/m2；無抗體刺激組男17例，女19例，平均年齡(59.2±9.9)歲，體質(zhì)量指數(shù)(23.5±3.0)kg/m2。兩組患者的一般資料的差異具有可比性。糖尿病組納入標準：18歲≤年齡<75歲；均符合世界衛(wèi)生組織對2型糖尿病的診斷標準；不合并其他重大器官損傷；資料齊全；自愿參加本研究并對研究知情同意。排除標準：1型糖尿病患者；合并2型糖尿病的急性并發(fā)癥患者；合并腫瘤的患者；合并嚴重的感染及炎癥反應的患者；合并服用對血糖有影響的藥物的患者；合并精神類疾病的患者。同期進行健康體檢者55例作為對照組。健康體檢者的納入標準：年齡18歲≤年齡<75歲；資料齊全；不合并其他器官的重大疾病。排除標準：合并腫瘤的患者；合并精神類疾病的患者；不愿參加本研究的患者。

1.2方法:比較兩組患者的血糖相關指標，包括空腹血糖、糖化血紅蛋白、穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)、穩(wěn)態(tài)模型胰島素B功能指數(shù)；比較兩組患者TIM-3的表達情況，比較兩組患者T細胞分泌細胞因子相對量。進一步比較通過抗TIM-3抗體刺激對糖尿病患者T細胞分泌細胞因子相對量。其中，T細胞分泌細胞因子包括CD4+T細胞的分泌細胞因子：白介素-4(Interleukin-4，IL-4)，IL-10，IL-17，IL-22，IL-35，干擾素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)，CD8+T細胞的分泌細胞因子：腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor - α，TNF-α)，IFN-γ。T細胞制備及檢測： 制備外周血單個核細胞，清晨，取外周血5mL，采用淋巴細胞分離液以及密度梯度離心法分選外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，將其儲存在液氮中備用。檢測T細胞中的TIM-3的表達，取PBMC細胞，置入熒光激活細胞分類儀(fluorescent-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)管中，洗滌后加入抗CD8-APC、抗CD4-FITC、抗TIM-3-PE，在適宜的避光孵育，再通過多聚甲醛進行固定，采用FACS Calibur 流式細胞儀檢測，采用相關的軟件進行分析。T細胞的純化和培養(yǎng)，采用CD4+細胞，CD8+細胞分選試劑盒，采用磁珠分離法對CD4+細胞，CD8+細胞進行純化。具體方法為：取107個PBMC，離心后去掉上清，加入緩沖液，再加入生物素標記的抗體雞尾酒，在適宜的溫度下孵化。再加入CD4+細胞，CD8+細胞免疫磁珠，再繼續(xù)在適宜的溫度下孵育。再使用緩沖液沖洗分離柱，并置于磁力分離架上，并將細胞懸液置于分離柱上，通過分離柱純化CD4+細胞，CD8+細胞。抗TIM-3抗體刺激：在通過含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，再向培養(yǎng)基中加入抗TIM-3抗體，培養(yǎng)12h以后，收集上清液和細胞進行后續(xù)實驗。細胞因子測定：采用酶聯(lián)免疫反應對上清液中的細胞因子進行檢測，其中包括腫瘤壞死因子(TNF-α)，IFN-γ，IL-10，IL-17，IL-22，IL-35，IL-4，具體的操作步驟均按照試劑盒的說明書進行。

2 結 果

2.1比較兩組T細胞中的TIM-3含量的變化:糖尿病組患者的CD4+T和CD8+T細胞的含量均顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組T細胞中的TIM-3含量的變化

2.2比較兩組CD4+T細胞分泌的細胞因子的含量變化:糖尿病組患者的INF-γ、IL-4、IL-17、IL-22含量顯著低于對照組，糖尿病組患者的IL-10、IL-35含量高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組CD4+T細胞分泌的細胞因子的含量變化

2.3比較兩組CD8+T細胞分泌的細胞因子的含量變化:糖尿病組TNF-α、INF-γ的含量低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 兩組CD8+T細胞分泌的細胞因子的含量變化

2.4是否經(jīng)過抗TIM-3抗體刺激對CD4+T細胞分泌的細胞因子的含量變化:經(jīng)過抗TIM-3抗體刺激后的糖尿病患者INF-γ、IL-17、IL-22的含量明顯高于無抗體刺激糖尿病患者，經(jīng)過抗TIM-3抗體刺激后糖尿病患者IL-35的含量明顯低于無抗體刺激糖尿病患者，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 抗TIM-3抗體刺激對CD4+T細胞分泌的細胞因子的含量變化

2.5是否經(jīng)過抗TIM-3抗體刺激對CD8+T細胞分泌的細胞因子的含量變化:經(jīng)過抗TIM-3抗體刺激后的糖尿病患者TNF-α、INF-γ含量高于無抗體刺激糖尿病患者，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表5。

表5 抗TIM-3抗體刺激對CD8+T細胞分泌的細胞因子的含量變化

3 討 論

2型糖尿病發(fā)生的主要機制是胰島素抵抗，胰島素抵抗的發(fā)生與發(fā)展主要涉及胰島素與其受體結合的相互作用，最關鍵的機制是胰島素受體信號傳導通路的損傷[6]。有研究[7]證實，胰島素受體的信號通路與炎癥因子的信號存在交叉作用，與T細胞等細胞亦存在密切的聯(lián)系，因此，研究糖尿病患者T細胞功能改變對治療糖尿病至關重要，T細胞免疫球蛋白與黏蛋白結構域蛋白-3是主要影響T細胞功能的蛋白，本研究主要探討T細胞免疫球蛋白與黏蛋白結構域蛋白-3對2型糖尿病患者T細胞的影響，以期為臨床治療糖尿病提供科學基礎。

TIM-3的主要功能是抑制CD4+T細胞和CD8+T細胞的活性并進一步降低炎癥因子的分泌，與健康的體檢者相比，糖尿病患者自然殺傷細胞T細胞以及T細胞表面TIM-3的表達量均明顯提升[8]。TIM-3可以有效的抑制內(nèi)皮細胞中低密度脂蛋白致使形成斑塊，而且TIM-3與諸多的疾病有關，但是，尚未見TIM-3在糖尿病患者中的相關報道。本研究結果顯示，與正常的對照組相比，糖尿病患者CD4+T細胞和CD8+T細胞中的TIM-3陽性細胞的比例明顯升高。許多的慢性疾病以及惡性腫瘤患者均合并T細胞功能不全以及功能衰竭等癥狀，致使機體內(nèi)產(chǎn)生免疫耐受，使其不能進一步殺傷病原體以及腫瘤細胞，使得機體內(nèi)的感染嚴重惡化，腫瘤異常生長[9]。有動物實驗研究證實[10]，CD4+T細胞亞群的功能抑制會促使巨噬細胞的分化方向不同，炎性細胞Th1以及Th17的比例嚴重升高，可進一步促進巨噬細胞向炎性巨噬細胞分化，并提升其炎性介質(zhì)白細胞介素家族的提升，以及腫瘤壞死因子和干擾素等與炎癥相關的因子。

T細胞亦與胰島素的合成存在密切的聯(lián)系，T細胞的活性提升以及功能的改變均可能會進一步影響糖尿病患者病情。而在糖尿病患者的研究中發(fā)現(xiàn)CD4+T細胞會發(fā)生異常活化以及異常增殖，主要表現(xiàn)為Th1和Th17細胞應答降低最為明顯，而Treg細胞的應答明顯增強，CD8+T細胞的作用降低，這一系列的研究均明確的提升在糖尿病患者中T細胞的功能降低。與以往的其他慢性疾病的研究存在一定的差異，可能的原因是與本研究的納入的樣本量較少，或者糖尿病患者的病情較輕等原因，這一系列的研究均需要更大樣本量，以及體內(nèi)的研究加以驗證。

本研究在后續(xù)的研究中也對TIM-3蛋白的活性加以抑制，探討其對糖尿病患者T細胞的影響，研究結果提示，在加入了抗TIM-3抗體后，患者的Th1、Th17細胞的活性均顯著的提升，CD8+細胞的活性亦明顯提升，但是卻對Tregs的調(diào)節(jié)功能的影響較小。

綜上所述，在糖尿病患者中T細胞表面黏蛋白結構域蛋白-3的表達量提升，含量會升高，其可能參與了2型糖尿病患者T細胞調(diào)節(jié)功能，但是具體的機制尚需深入研究。