miR-497 CCNE1在非小細胞肺癌組織中的表達及與預后的關(guān)系

丁靈芝, 羅向軍, 陳偉偉, 楊愛珍

2.青島大學附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科, 山東 青島 266100)

非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)是最常見的肺癌類型，約占所有肺癌類型的75%～80%，其死亡率位居惡性腫瘤首位[1]。微小RNA(miRNA) 是一類由20～25個核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，參與細胞分化增殖、凋亡等多種病理生理過程，miRNA表達異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)聯(lián)，是NSCLC高敏感性、非侵入性生物標志物[2]。miR-497廣泛參與炎癥反應、纖維化、細胞增殖、凋亡等病理生理過程，現(xiàn)有報道顯示miR-497在多種惡性腫瘤異常表達，并作為抑癌基因參與惡性腫瘤發(fā)生和進展[3]。細胞周期蛋白E1(Cyclin E1，CCNE1)是細胞周期G1期調(diào)控因子，主要負責正性調(diào)控細胞周期自G0G1期向S期轉(zhuǎn)換，促使細胞增殖，CCNE1在漿液性卵巢癌中表達上調(diào)，與低生存率有關(guān)[4]。現(xiàn)有研究顯示CCNE1是miR-497下游靶點，miR-497/ CCNE1在宮頸癌細胞增殖和腫瘤進展方面發(fā)揮重要作用[5]。在NSCLC發(fā)病過程中，miR-497、CCNE1之間的關(guān)系尚不清楚，鑒于此，本研究檢測NSCLC組織miR-497、CCNE1表達，分析其與臨床病理特征和預后的關(guān)系，結(jié)果報道如下：

1 資料與方法

1.1一般資料:本研究獲得我院倫理會批準，選擇2016年2月至2017年12月我院收治的102例NSCLC患者，納入標準：①均行胸腔鏡下肺癌根治手術(shù)，經(jīng)術(shù)后組織病理學證實為NSCLC；②TNM分期Ⅰ～Ⅲ期；③臨床資料完整，配合隨訪。排除標準：①術(shù)前接受新輔助放化療者；②經(jīng)病理證實為其它類型肺癌；③合并其它部位原發(fā)惡性腫瘤；④TNM分期Ⅲ期以上或不具備手術(shù)指征者；⑤隨訪失聯(lián)者。患者及其家屬均知情同意簽署同意書。

1.2熒光定量聚合鏈反應(qRT-PCR)檢測 miR-497、CCNE1表達:選取NSCLC患者手術(shù)切除的癌組織(NSCLC組)及癌旁組織(距腫瘤組織邊緣≥5 cm)(癌旁組)標本，剪成 1 mm3加入RNA保護液液氮冷凍保存。液氮預冷研缽，磨成粉末，加入Trizol RNA 提取試劑(美國Thermo Fisher公司)參照說明書分步提取組織RNA。通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，選取吸光度260/280比值位于1.9～2.1的 RNA，M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(Epicentre 公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取2μL cDNA樣品加入實時qRT-PCR體系，采用CFX96實時熒光PCR儀(美國Bio-Rad)運用qRT-PCR檢測miR-497、CCNE1表達。引物合成及序列測定由上海基康公司完成(表1)。反應條件：95℃預變性10min,95℃變性10 s,60℃退火20 s,72℃延伸10 s ，40個循環(huán)。反應體系：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (2×)12.5μL ，dNTP1.6μL，Taq DNA 聚合酶1μL，上下游引物 10μmoL/L各1μL，加反應緩沖液至25μL。75℃讀取熒光，構(gòu)建溶解曲線。以GAPDH RNA 為內(nèi)參，2-ΔΔCt計算miR-497、CCNE1相對表達量，共做3 次平行試驗，取平均值。ΔΔCt miR-497 =ΔCt miR-497 -ΔCt GAPDH snRNA，ΔΔCt CCNE1 =ΔCt CCNE1 -ΔCt GAPDH snRNA。

表1 引物序列

1.3隨訪:所有NSCLC患者出院后采用電話或者門診等方式定期隨訪，每兩個月隨訪1次，出院后隨訪3年。統(tǒng)計隨訪期間患者腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移、死亡情況。無進展生存期(Progression-free survival，PFS)定義為自接受手術(shù)日期至腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移或發(fā)生任何原因死亡或隨訪結(jié)束時間，總生存期(Overall survival，OS)定義為接受手術(shù)日期到因任何原因引起的死亡或隨訪結(jié)束時間。

2 結(jié) 果

2.1NSCLC組、癌旁組miR-497、CCNE1表達比較:NSCLC組miR-497表達低于癌旁組(P<0.001)，CCNE1表達高于癌旁組(P<0.001)，見表2。

表2 NSCLC組癌旁組miR-497及CCNE1表達比較

2.2miR-497、CCNE1表達與NSCLC病理特征的關(guān)系:腫瘤直徑≥5cm、低中度分化、TNM分期Ⅲ期miR-497表達低于腫瘤直徑<5cm、高度分化、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期(P<0.001)，CCNE1表達高于腫瘤直徑<5cm、高度分化、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期(P<0.001)。不同年齡、性別、病理類型、是否目前吸煙者miR-497、CCNE1表達比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，見表3。

表3 不同NSCLC病理特征間miR-497及CCNE1表達差異

2.3miR-497、CCNE1的相關(guān)性分析:Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示miR-497表達與CCNE1呈負相關(guān)(r=-0.539，P<0.001)，見圖1。

圖1 miR-497與CCNE1散點圖

2.4不同miR-497、CCNE1表達的NSCLC患者生存率比較:中位隨訪21個月，隨訪期間復發(fā)12例，遠處轉(zhuǎn)移19例，死亡55例。根據(jù)miR-497、CCNE1表達均值將患者分為miR-497高表達組(miR-497≥0.56，50例)和miR-497低表達組(miR-497<0.56，52例)，CCNE1高表達組(CCNE1≥1.05，53例)和CCNE1低表達組(CCNE1<1.05，49例)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，miR-497低表達組PFS生存率、OS生存率分別為5.66%(3/52)、26.92%(14/52)，低于miR-497高表達組的26.00%(13/50)、66.00%(33/50)(Log-Rank2=7.703、14.130，P=0.006、<0.001)，CCNE1高表達組PFS生存率、OS生存率分別為3.77%(2/53)、32.08%(17/53)，低于CCNE1低表達組的28.57%(14/49)、61.22%(30/49)(Log-Rank2=13.120、9.400，P=0<0.001、0.002)，見圖2。

圖2 不同miR-497、CCNE1表達下NSCLC患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.5影響NSCLC患者預后的危險因素:以NSCLC患者隨訪期間預后生存情況為因變量(1=死亡，0=存活，t=生存期)，納入年齡(賦值：連續(xù)性變量)、性別(賦值：1=男，2=女)、目前吸煙(賦值：1=否，2=是)、病理分型(賦值：1=腺癌，2=鱗癌)、腫瘤大小(賦值：1=<5cm，2=≥5cm)、分化程度(賦值：1=高度分化，2=低中度分化)、TNM分期(賦值：1=Ⅰ～Ⅱ期，2=Ⅲ期)、miR-497(賦值：1=miR-497≥0.56，2=miR-497<0.56)、CCNE1(賦值：1=CCNE1<1.05，2=CCNE1≥1.05)為自變量。單因素Cox比例風險回歸分析結(jié)果顯示腫瘤≥5cm、低中度分化、TNM分期Ⅲ期、miR-497<0.56、CCNE1≥1.05與NSCLC患者不良預后發(fā)生有關(guān)(P<0.05)，見表4。多因素Cox比例風險回歸分析顯示TNM分期Ⅲ期、miR-497<0.56、CCNE1≥1.05是NSCLC患者不良預后的危險因素(P<0.01)，見表5。

表4 影響NSCLC患者預后的單因素Cox比例風險回歸模型

表5 影響NSCLC患者預后的多因素Cox比例風險回歸模型

3 討 論

肺癌是嚴重威脅人類生命安全的惡性腫瘤，2014年我國每年新發(fā)78.15萬例肺癌病例，死亡病例達到62.64萬例，發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤首位[6]。尋找新的精確診斷NSCLC的非侵入性診斷方法，對危險分層、療效評估、預后預測均有重要意義。miRNA具有翻譯、調(diào)控基因表達功能，是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡的核心調(diào)控因子。miRNA主要通過與3'UTR配對降解或抑制靶基因mRNA，調(diào)控細胞增殖分化和凋亡，影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，在腫瘤進展發(fā)揮抑癌或促癌基因功能。

miR-497位于人類染色體17p13.1，屬于miR-15家族，廣泛表達于大腦、乳房、肺、腎臟、胃、肝臟和血液中，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌基因作用[7]。現(xiàn)有研究顯示，miR-497在胃癌中表達下調(diào)，miR-497可靶向丙酮酸脫氫酶激酶3(PDK3)，抑制DNA合成，促使胃癌細胞凋亡，抑制miR-497表達可促使胃癌細胞增殖和生長[8]。miR-497可直接靶向B7家族成員CD274，影響三陰乳腺癌細胞免疫逃逸和腫瘤進展[9]。miR-497在前列腺癌表達降低，miR-497過表達可IκB激酶β、基質(zhì)金屬蛋白酶9、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶8表達抑制前列腺癌增殖、遷移和侵襲，促使癌細胞凋亡，增加對化療敏感性[10]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-497在NSCLC中表達下調(diào)，說明miR-497表達與NSCLC惡性生物學行為有關(guān)，miR-497參與NSCLC的機制尚不完全明確，現(xiàn)有研究顯示miR-497可通過靶向YAP1抑制NSCLC增殖[11]，miR-497還通過與Smad泛素化調(diào)節(jié)因子2(SMURF2)的3'UTR結(jié)合抑制SMURF2的表達，miR-497表達降低導致SMURF2依賴的轉(zhuǎn)化生長因子-β信號通路激活，提高轉(zhuǎn)化生長因子-β對肺癌細胞的侵襲能力[12]，促進肺癌細胞的增殖、侵襲遷移，導致腫瘤惡性進展。

CCNE1屬于細胞周期蛋白家族，具有調(diào)控蛋白合成、DNA復制等功能，通過特異性結(jié)合細胞周期蛋白依賴性激酶2正性調(diào)控細胞從G0G1期進入S期。在正常的細胞周期有絲分裂過程中，CCNE1循環(huán)表達和降解，在惡性腫瘤中CCNE1過表達，導致細胞有絲分裂混亂，DNA異常復制和不穩(wěn)定性增加[4]。研究指出，CCNE1在卵巢癌中高表達，是不良預后的影響因子[13]。CCNE1在鼻咽癌中高表達，并通過PI3K/AKT通路促進鼻咽癌細胞的增殖、侵襲和遷移。本研究結(jié)果顯示NSCLC組織中CCNE1成高表達，CCNE1過表達與腫瘤直徑、分化程度以及TNM分期均有關(guān)，說明CCNE1在NSCLC中可能發(fā)揮致癌基因作用，CCNE1過表達可能導致NSCLC細胞過度增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，與NSCLC惡性進展有關(guān)。CCNE1表達受多種基因調(diào)控，本研究發(fā)現(xiàn)CCNE1表達與miR-497呈負相關(guān)，提示miR-497、CCNE1在NSCLC發(fā)病和進展中可能發(fā)揮負向調(diào)控作用機制。現(xiàn)有報道顯示miR-497可與CCNE1的3'UTR靶向結(jié)合抑制CCNE1表達，發(fā)揮抑制肺癌細胞增殖、腫瘤形成和生長作用[14]。結(jié)合上述報道和本研究結(jié)果，推測miR-497/ CCNE1軸可能參與了NSCLC發(fā)病和惡性進展機制。

本研究通過隨訪發(fā)現(xiàn)miR-497、CCNE1均與NSCLC預后有關(guān)，miR-497高表達、CCNE1低表達是NSCLC患者3年存活率低下的危險因素。分析機制為miR-497表達缺失，導致其調(diào)控的細胞周期蛋白CCNE1過度表達，進而誘導癌細胞惡性增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，以及不良結(jié)局的發(fā)生[14]。

綜上，NSCLC組織中miR-497表達下調(diào)，CCNE1表達上調(diào)，miR-497與CCNE1呈負相關(guān)，提示miR-497可能通過負向調(diào)控CCNE1參與NSCLC惡性增殖、侵襲以及不良預后的發(fā)生。miR-497、CCNE1有望作為NSCLC預后預測的潛在標志物和治療的潛在靶點。