SFRP1/Wnt/β-catenin通路在宮頸癌干細胞中的作用

吳琳 張科 祖珍玉 陳潔 毛聿華 羅敏

1南方醫科大學第一臨床醫學院（廣州510515）；2中國人民解放軍南部戰區總醫院婦產科（廣州510000）

宮頸癌是全球第四大最常見女性惡性腫瘤［1］，其常規治療為手術結合放化療，但部分患者對治療存在抵抗能力，治療后仍出現復發轉移的情況。腫瘤干細胞被認為是惡性腫瘤轉移及復發的種子細胞［2-3］。針對宮頸癌干細胞的研究能更精準靶向腫瘤轉移復發的種子細胞，從而改善難治性宮頸癌患者的預后情況。

分泌型卷曲相關蛋白1（secreted frizzled related protein l，SFRPl）在結構上與FZ 受體極為相似，可通過競爭性結合Wnt 分子或Fz 受體而直接抑制Wnt 通路［4-5］，SFRP1 在多種腫瘤組織（乳腺癌［6］、腎細胞癌［7］、結腸癌［8］、膀胱癌［9］等）中低表達，可抑制腫瘤的發生發展。Wnt 通路下游目的基因（如C-myc、CyclinD1 等）參與細胞生存、增殖和分化［10-11］，Wnt/β-catenin 通路在腫瘤中發揮維持腫瘤干細胞干性、誘導腫瘤細胞上皮間質轉化，促進腫瘤細胞增殖、遷移等作用［12-13］。因此，SFRP1 可抑制Wnt/β-catenin 通路的激活，阻斷Wnt/β-catenin通路促進腫瘤干細胞發揮功能的作用。

有研究［14-15］發現SFRP1 在正常宮頸組織中表達明顯高于宮頸癌組織，敲除SFRP1 后，宮頸癌細胞具有更強的腫瘤惡性表型。但SFRP1 在宮頸癌干細胞中的表達情況及其如何調控Wnt 信號影響宮頸癌干細胞的功能尚不明確。故本研究通過體內外功能實驗驗證側群干細胞（side population cell，SP）具有腫瘤干細胞的能力；同時檢測SFRP1及Wnt 通路關鍵蛋白的表達及SFRP1 的表達水平，初步探討宮頸癌干細胞中SFRP1 對Wnt 通路的調控作用，為確定宮頸癌干細胞的治療靶點提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料來源人宮頸癌SiHa 細胞系，由中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心提供。無特定病原體（SPF）級BALB/c 裸鼠由廣東省醫學實驗動物中心提供，共10 只，4 ～5 周齡，雌性，體重為18 ～20 g。

1.2 主要試劑CCK8 試劑盒、Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基；EdU-594細胞增殖檢測試劑盒購自上海碧云天；順鉑、紫杉醇為美國Abmole 公司產品；維拉帕米鹽酸鹽為美國Sigma Aldrich 公司產品；抗體SFRP1、β-catenin、C-myc、CyclinD1、β-actin 均購自美國proteintech 公司，二抗購自弗德生物。

1.3 細胞分組及處理將SP細胞及非側群干細胞（non side population cell，NSP）接種于培養板內，待細胞處于對數生長期時，棄去舊培養基后PBS 洗滌后，加入無血清腫瘤干細胞培養基刺激24 h，分為空白對照組、紫杉醇組、順鉑組、放療組。其中空白對照組為后續不予處理；紫杉醇組為加入紫杉醇（2.5 nmol/L）處理48 h；順鉑組為加入順鉑（50 mol/L）處理48 h；放療組為經直線加速放射線照射相應劑量射線后48 h。

1.4 流式分選側群干細胞制備SiHa 細胞的單細胞懸液，將細胞濃度調整為1 × 106/mL，預熱細胞至37 ℃后分為兩組。實驗組及對照組均加入Hoechst33342 5 g/mL，37 ℃水浴中避光標記90 min。同時對照組中加入維拉帕米50 mol/mL。標記后于冰浴中終止染色，預冷PBS 洗滌2 次。再向兩組中加入PI，隨后上機分選。

1.5 EDU 法檢測細胞增殖水平將各組細胞接種于96 孔板中，1 000/孔，處理后，10 mol/L EDU 染色孵育2 h；取出進行洗滌、固定、通透，按照說明書配制Click 反應溶液進行Click 點擊反應，再次洗滌后用hoechst33342 染細胞核，倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.6 平板克隆實驗檢測細胞的克隆形成能力將各組細胞接種于6 孔板中，接種細胞數目為50 ～3 000/孔，處理后，繼續培養，4 d 更換一次培養基，接種14 d 后，洗滌、固定、染色，隨后用數碼照相機拍照。

1.7 動物實驗將10 只裸鼠隨機分為兩組，每組5 只，在裸鼠5 周齡時，將SP 及NSP 細胞的密度調整至1 × 107/mL，每只裸鼠腹股溝皮下接種腫瘤細胞0.1 mL，接種后定期觀察裸鼠，待觸摸到實體瘤形成后，每7 天測量1 次，并記錄移植瘤的最長徑（L）和最短徑（W），計算腫瘤體積，腫瘤體積=L×W2/2，繪制裸鼠移植瘤生長曲線，在接種第35 天處死裸鼠，剝除移植瘤，測量移植瘤大小并稱重。

1.8 蛋白印跡法（WB）檢測細胞蛋白的表達提取各組細胞的蛋白并測定蛋白濃度；按照30 g 蛋白上樣，電泳轉膜后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，相應抗體4 ℃孵育過夜；次日洗滌后二抗室溫孵育1 h 后再次洗滌；運用增強化學發光法的發光液顯影，以β-actin 作為內參照，凝膠成像系統拍照。

1.9 酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測細胞分泌SFRP1 水平加入標準品或樣品后37 ℃孵育2 h；棄去液體，加生物素標記抗體工作液，37 ℃孵育1 h；洗板后加HRP 標記親和素工作液，37 ℃孵育1 h；洗板后加底物溶液，37 ℃孵育15 min；加終止液，終止反應5 min 內用酶標儀檢測450 nm 波長處的光密度值。

1.10 免疫熒光檢測β-catenin的表達及細胞亞定位情況取出樣品，洗滌后4%多聚甲醛固定15 min；洗滌后0.3%TritonX-100通透10 min，洗滌后山羊血清封閉液封閉60 min；加入一抗4 ℃孵育過夜。次日洗滌后加入熒光染料標記的二抗避光孵育90 min；洗滌后DAPI 核染色劑避光孵育10 min，洗滌后加入防熒光淬滅劑。熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.11 統計學方法采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。計量資料經正態性檢驗符合正態分布，以均數±標準差表示，比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 流式分選SP 細胞和NSP 細胞在Hoechst Red-Hoechst Blue 散點圖中，標記Hoechst33342 后，細胞呈現“鷹頭”形狀，鷹頭的“鷹嘴”部分代表SP細胞（圖1）。

圖1 流式分選SiHa 細胞中的SP 細胞和NSP 細胞Fig.1 Flow cytometric separation of SP cells and NSP cells in SiHa cells

2.2 SP及NSP細胞體內外功能比較EDU實驗證實SP 細胞的增殖率高于NSP 細胞［（22 ± 1）%vs.（13±3）%，P=0.017 1，圖2A、B］；克隆形成實驗發現SP 細胞的克隆形成率高于NSP 細胞［（51±7）%vs.（9±6）%，P=0.010 1，圖2C、D］；無血清成球實驗在第2 天可見細胞分裂，有成球的趨勢，隨后細胞球逐漸長大，至第10 天可見折光度好、中間密度高的致密球，發現SP 細胞的成球能力強于NSP細胞（圖2E）。SP 細胞的裸鼠皮下腫瘤生長速度明顯快于NSP，剝離腫瘤組織后測量其腫瘤重量，發現SP 細胞的腫瘤重量明顯重于NSP 細胞所形成的腫瘤［（913.6 ± 137.3）mgvs.（307.2 ± 36.5）mg，P=0.002 7，圖3］。

圖3 SP 細胞的裸鼠皮下成瘤能力明顯強于NSP 細胞Fig.3 The ability of SP cells to form subcutaneous tumors in nude mice in vivo is significantly stronger than that of NSP cells

圖2 SP 細胞增殖、克隆及成球能力強于NSP 細胞Fig.2 SP cells have stronger proliferation，cloning and spheronization ability than NSP cells

2.3 SP 和NSP 細胞的干性標志物表達比較WB發現在運用條件培養基刺激24 h 之后的SP 細胞中CD133、CD44、Nanog 的表達均強于NSP 細胞，而使用完全培養基培養時，SP 細胞與NSP 細胞在三個分子表達量上無明顯差異（圖4）。

圖4 SP 細胞及NSP 細胞的干性標志物表達情況Fig.4 The expression of stemness markers in SP cells and NSP cells

2.4 放化療條件下SP 和NSP 細胞的增殖及克隆形成能力比較根據EDU 實驗結果，用紫杉醇（2.5 nmol/L）、順鉑（50 μmol/L）、放射劑量8 Gy 處理時，SP 細胞的增殖率分別為（22±1）%、（62±2）%、（20±4）%，NSP 細胞增殖率分別為（13±3）%、（17± 9）%、（5 ± 1）%，經過統計分析后，不同處理組SP 細胞及NSP 細胞的增殖率差異均有統計學意義（均P＜0.001）。見圖5。平板克隆形成實驗提示在經過2、4、6、8 Gy放射劑量照射后，SP細胞的克隆形成率分別為（20 ± 3）%、（7 ± 1）%、（19.7 ± 1.9）‰、（5.2 ± 0.1）‰，而NSP 細胞的克隆形成率分別為（10±1）%、（2±0.3）%、（5.8±0.5）‰、（1.9±0.3）‰，經過統計分析后，發現在不同放射劑量照射后，SP細胞的克隆形成能力均明顯強于NSP 細胞（均P＜0.005）。見圖6。

圖6 放療時宮頸癌干細胞的克隆形成能力明顯強于非宮頸癌干細胞Fig.6 During radiotherapy，the cloning ability of cervical cancer stem cells is significantly stronger than that of non-cervical cancer stem cells

圖5 放化療條件下SP 細胞與NSP 細胞增殖能力變化Fig.5 Changes in the proliferation ability of SP cells and NSP cells under radiotherapy and chemotherapy

2.5 SFRP1 在細胞內外的水平WB 提示SFRP1在SP 細胞明顯高于NSP 細胞（圖7）；ELISA 發現SiHa-NSP 細胞的SFRP1 蛋白分泌水平明顯高于SiHa-SP 細胞［（66.47±3.60）pg/mLvs.（6.75±0.45）pg/mL，P＜0.000 1），說明細胞內的SFRP1表達水平與SFRP1 的分泌并不呈現正相關的關系。

圖7 SP 細胞及NSP 細胞SFRP1 在細胞內外的水平Fig.7 The levels of SFRP1 in SP cells and NSP cells inside and outside the cell

2.6 Wnt/β-catenin 通路激活情況WB 結果顯示β-catenin、C-myc、Cyclin D1 在SP 細胞中的表達水平均高于NSP 細胞；免疫熒光發現Wnt 通路發揮關鍵作用的β-catenin 在SP 細胞中主要表達于細胞質及細胞核內，而在NSP 細胞的β-catenin 主要表達在細胞質（圖8）。

圖8 SP 細胞中Wnt/β-catenin 通路明顯激活Fig.8 Wnt/β-catenin signaling pathway is obviously activated in SP cells

3 討論

難治性宮頸癌在經過常規治療后仍易出現轉移及復發等預后不良的情形，完成同步放化療后，局部晚期宮頸癌婦女的5年總存活率約為70%，而僅限于子宮頸或上陰道的復發性宮頸癌是可能治愈的［2］。腫瘤干細胞學說認為宮頸癌干細胞是腫瘤轉移及復發的種子細胞［2］。根據運用流式分選從細胞株中分離出SP 細胞的方法［16］，本研究從宮頸癌細胞中分選出的SP 細胞經過無血清培養基刺激后，從體內外功能、分子生物學多角度驗證了其干細胞特性。

本研究對SP 細胞及NSP 細胞在經過放射或化療藥物的處理后，SP 細胞具有更明顯的惡性表型，說明宮頸癌干細胞對放化療的抵抗能力強于非宮頸癌干細胞，與前人研究結果一致［17-18］。宮頸癌干細胞不能被常規治療完全消滅，繼而導致腫瘤轉移復發，因此，進一步研究其具體機制對于改善難治性宮頸癌患者預后具有重要意義。

SFRP1 在宮頸癌組織中的表達明顯低于正常宮頸組織［14］，敲低SFRP1 的表達后，Wnt 通路促進宮頸癌的進展［15］。但本研究卻發現SP 細胞中Wnt/β-catenin 通路與SFRP1 的表達趨勢具有一致性。為了明確其中的原因，結合細胞分泌SFRP1阻礙Wnt與FZ受體結合，從而阻斷Wnt/β-catenin通路激活這一現象［19］，本研究發現SP 細胞的SFRP1分泌水平明顯低于NSP 細胞，由此得出SP 細胞的SFRP1 分泌水平下降，可能解除其對Wnt/β-catenin通路的抑制作用，促進Wnt/β-catenin 通路激活。

綜上所述，宮頸癌干細胞可能通過抑制SFRP1分泌來促進Wnt/β-catenin 通路激活宮頸癌干細胞的功能，使其具有更強的增殖、克隆形成、放化療抵抗及皮下成瘤能力。因此，進一步探討SFRP1對于宮頸癌干細胞的具體作用，需觀察SFRP1 基因過表達或沉默后，宮頸癌干細胞的體內外生物學行為變化；闡明宮頸癌干細胞中抑制SFRP1 分泌至細胞外的具體機制，由此設計相關靶向藥物達到抑制宮頸癌干細胞的作用。