卵母細胞玻璃化冷凍的臨床應用價值

孫賢 姜宏 劉迎春 倪豐 朱杰

1安徽醫科大學解放軍臨床學院生殖醫學中心（合肥230031）；2中國人民解放軍聯勤保障部隊第901 醫院生殖醫學中心（合肥230031）

三十年前澳大利亞學者首次實現凍融卵母細胞妊娠和活產［1］，為凍融卵母細胞的臨床應用提供了理論與實踐基礎。玻璃化冷凍技術較傳統的程序化慢速冷凍技術具有簡單、快捷、不需要昂貴的程序化冷凍儀等優點，并可顯著提高凍融卵母細胞及胚胎的復蘇率和發育潛能，改善其臨床結局，已廣泛應用于輔助生殖技術（assisted reproductive technology，ART）領域［2-3］。由于卵母細胞自身的形態學特點，其冷凍復蘇率及復蘇后的發育潛能遠低于精子及胚胎，但隨著玻璃化冷凍技術的發展，卵母細胞的冷凍復蘇率大幅提高，已從最初主要應用于女性患者放、化療前的生育力保存，拓展到實施ART 過程中取卵日因各種原因無法獲得可用精子的被動卵母細胞冷凍，以及因延遲生育進行女性生育能力保存的主動卵母細胞冷凍，成為ART 的重要組成部分［2，4］。

目前卵母細胞玻璃化冷凍技術雖已在全國各大中心相繼開展，但其臨床應用遠不及精子及胚胎，筆者通過回顧性分析本中心卵母細胞玻璃化冷凍患者的臨床結局，旨在探討凍融卵母細胞單精子注射-胚胎移植（intracytoplasmic sperm injection-embryo transfer，ICSI-ET）的可行性、安全性及臨床價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象與分組回顧性分析2013年1月-2019年12月在安徽醫科大學解放軍臨床學院生殖醫學中心行凍融卵母細胞ICSI-ET 共113 個周期的臨床資料，將其設為凍卵組，按1：3 比例隨機抽取同期行新鮮周期ICSI-ET 共339 個周期作為對照組。納入標準：（1）年齡＜40 歲，FSH＜10 mIU/mL，AMH＞1.1 ng/mL；（2）移植胚胎均為卵裂胚；（3）取卵周期數≤2 次。排除標準：（1）男、女任一方染色體異常；（2）盆腔結核；（3）嚴重子宮內膜異位癥；（4）復發性流產；（5）宮腔粘連；（6）高泌乳素血癥；（7）合并嚴重全身性疾病及內分泌疾病。

1.2 方法

1.2.1 控制性促排卵（controlled ovarian stimulation，COS）方案包括拮抗劑、長方案、微刺激、高孕激素降調及黃體期促排卵方案，結合陰道B超和血清FSH、LH、E2、P 水平監測卵泡發育情況，適時調整促性腺激素（Gn）劑量，當2 個主導卵泡直徑≥18 mm 或3 個≥17 mm 時，皮下注射人絨毛膜促性腺激素（hCG，艾澤，默克雪蘭諾，意大利）250 μg，36 h 后B 超引導下經陰道穿刺取卵。

1.2.2 卵母細胞玻璃化冷凍采用日本加藤公司冷凍試劑盒對卵母細胞行玻璃化冷凍，冷凍方法參照操作說明適當調整。將成熟（MII）卵母細胞置入冷凍試劑1（ES）中6～8 min，期間觀察卵胞漿在ES 中的形態變化，待卵胞漿完全恢復進行下一步。如10 min 形態仍未恢復可延長ES 作用時間，但不超過15 min，隨即將卵母細胞移入冷凍試劑2（VS）中平衡1 min，裝載入冷凍載桿，快速投入液氮。

1.2.3 卵母細胞解凍激素替代（hormone replace treatment，HRT）周期內膜轉化日行卵母細胞復蘇，按照操作說明進行。將卵母細胞依次置入解凍試劑1（TS）：1 min，解凍試劑2（DS）：3 min，解凍試劑3（WS1）：5 min，解凍試劑4（WS2）：5 min。之后轉入G-IVFPLUS 中孵育2 h。

1.2.4 解凍卵母細胞的存活標準解凍后存活卵母細胞在鏡下均勻透亮、透明帶完整、質膜無破裂、胞質無變性固縮及外流、卵周間隙均勻存在且無明顯增寬或消失、有立體折光；死亡卵母細胞外觀暗淡無光、體積增大、質膜邊界不清、胞質變性或固縮、無立體折光。

1.2.5 授精采用ICSI 方式對存活MII 卵母細胞授精，培養18 h 后觀察卵母細胞受精情況，D3 進行卵裂胚觀察和評分。可利用胚胎定義為D3 正常受精且5 個卵裂球Ⅲ級以上胚胎，優質胚胎定義為D3 正常受精且7 個卵裂球Ⅱ級以上胚胎。

1.2.6 子宮內膜準備凍卵組采用HRT 方案準備內膜，月經周期第2 ～3 天口服戊酸雌二醇（補佳樂）4 ～6 mg/d，當內膜厚度≥8 mm 時，肌肉注射黃體酮注射液40 mg/日或黃體酮凝膠1.25 mg/日（納陰）轉化內膜，轉化內膜第4 天進行胚胎移植，并繼續黃體支持。對照組于取卵后D3 進行胚胎移植，黃體支持方案同凍卵組。

1.2.7 胚胎移植及妊娠結局選擇1 ～3 枚D3 可利用胚胎移植（其中移植3 枚胚胎者均在2017年之前且前一周期種植失敗或年齡＞35 歲），移植后30 ～35 d 陰道超聲見孕囊定義為臨床妊娠，確診為宮內妊娠后，隨訪并記錄臨床結局。

1.3 統計學方法采用SPSS 21.0軟件包進行統計分析，結果以均數±標準差或百分率（%）表示，計量資料組間比較用t檢驗，計數資料組間比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 卵母細胞玻璃化冷凍原因分析本研究113個凍卵周期共凍存卵母細胞1 268 枚，凍卵原因包括取卵日男方無活精子（包括睪丸附睪穿刺未獲得精子）、男方取精失敗且拒絕睪丸附睪穿刺、取卵日家庭意外（親屬病亡、交通事故及家庭矛盾等）而行被動冷凍；女方獲卵數較多（≥25 枚），對部分卵母細胞（6 ～20 枚）行主動冷凍，見表1。

表1 卵母細胞冷凍原因分析Tab.1 Analysis of the causes of oocyte vitrification

2.2 患者基本情況由表2 可見，兩組間平均年齡、體質量指數（BMI）、不孕年限、基礎FSH 差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表2 兩組患者基本資料Tab.2 Basic data of patients between the two groups±s

表2 兩組患者基本資料Tab.2 Basic data of patients between the two groups±s

指標周期數（個）女方年齡（歲）BMI（kg/m2）不孕年限（年）基礎FSH（mIU/mL）凍卵組113 29.56±4.32 22.59±3.67 4.16±2.59 7.34±2.12對照組339 29.99±4.40 23.00±3.53 4.54±3.27 7.40±1.80 t 值/-0.899-1.050-1.271-0.276 P 值/0.369 0.294 0.205 0.783

2.3 兩組體外受精結果比較由表3 可見，1 268枚冷凍卵母細胞解凍后存活1 087 枚，復蘇率為85.73%。凍卵組的卵裂率、D3 優質胚胎率顯著低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），兩組間受精率、D3 可移植胚胎率、移植優質胚胎率、移植胚胎數差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表3 兩組體外受精結果比較Tab.3 Comparison of in vitro fertilization results between the two groups

2.4 臨床及新生兒結局比較凍卵組113 個周期行ICSI 后有可移植胚胎周期92 個，無可移植胚胎周期21 個，周期取消率為18.58%（21/113）；對照組339 個周期行ICSI 后有可移植胚胎周期306 個（行新鮮胚胎移植222 個周期，因預防OHSS、孕酮＞1.5 ng/mL 等原因行全胚冷凍84 個周期），無可移植胚胎周期33 個，占9.73%（33/339），無可移植胚胎周期率顯著低于凍卵組，差異有統計學意義（9.73%vs.18.58%，P＜0.05），兩組間種植率、臨床妊娠率、異位妊娠率、流產率、活產率、平均分娩孕周、平均新生兒出生體重及出生缺陷率差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 兩組患者臨床及新生兒結局比較Tab.4 Comparison of clinical and neonatal outcomes between the two groups±s，%

表4 兩組患者臨床及新生兒結局比較Tab.4 Comparison of clinical and neonatal outcomes between the two groups±s，%

注：*P ＜0.05

指標移植周期數（個）無可移植胚胎周期率（%）種植率（%）臨床妊娠率（%）異位妊娠率（%）流產率（%）活產率（%）平均分娩孕周（images/BZ_18_2163_439_2190_484.png±s，周）平均新生兒出生體重（images/BZ_18_2163_439_2190_484.png±s，g）出生缺陷率（%）凍卵組92 18.58（21/113）25.12（51/203）43.48（40/92）0 22.50（9/40）33.70（31/92）38.31±2.36 3 217.35±626.05 0對照組222 9.73（33/339）27.53（128/465）47.30（105/222）0 15.24（16/105）40.09（89/222）38.31±2.27 3 093.16±578.63 0 t/χ2值/6.309 0.416 0.382/1.071 1.126-0.002 1.067/P值/0.012*0.519 0.537/0.301 0.289 0.998 0.288/

3 討論

既往卵母細胞冷凍多用于卵巢功能不全、惡性腫瘤放化療前、子宮內膜異位癥及各種原因推遲生育女性的生育能力保存［5-8］。但在IVF-ET 周期中常遇到因取卵日男患者取精失敗或未獲得活精子，需實施卵母細胞緊急冷凍的情況［9-10］。本研究的結果顯示，該原因占本中心卵母細胞冷凍的64.60%，是實施被動卵母細胞冷凍的主要原因。該情況下，采取緊急卵母細胞冷凍策略，不僅可減輕患者的心理及精神負擔，還可節約治療費用。2013年美國已有50%以上的生殖中心實施卵母細胞冷凍技術，其中因醫療因素占18%，并將其列為成熟的臨床應用項目，在臨床廣泛應用［2，4］。

對于高齡女性生育群體、高齡失獨、罹患腫瘤及卵巢功能不全女性，由于其卵巢儲備功能下降及卵母細胞質量異常，常難以通過自身卵母細胞獲得子代，冷凍卵母細胞捐贈是該類患者獲得子代的有效途徑。本研究共對36 例獲卵數較多（≥25 枚）患者實施主動卵母細胞冷凍，占全部卵母細胞冷凍的31.86%。與精子相比卵母細胞更為稀缺和珍貴，且國內尚無卵子庫，因此對IVF 過程中部分年輕且獲卵數較多的患者凍存部分卵母細胞，不僅可為患者本人提供生育保險，同時可有效避免大量剩余胚胎的浪費，為有贈卵需求的不孕患者提供較高質量的卵源。

實現活產所需的冷凍卵母細胞數量是生殖醫學工作者和患者共同關注的問題。有研究表明活產率隨年齡的降低和冷凍卵母細胞數量的增加而增加［11］，每個冷凍卵母細胞的妊娠率為4.5% ～12%［12］，獲得1 個活產需要至少10 枚卵母細胞［13］，因此國內外學者認為需生育力保存而行卵母細胞冷凍的女性年齡應≤35 歲、每次至少冷凍保存卵母細胞8 ～10 枚［4，14］。本研究對113 例不孕患者實施卵母細胞冷凍，每周期主動冷凍者冷凍6 ～20 枚，被動冷凍者冷凍所有卵母細胞（5 ～30 枚），根據患者冷凍卵母細胞數每周期解凍5 ～20 枚，平均10 ～12 枚，活產率為33.70%，與對照組間差異無統計學意義（40.09%，P＞0.05）。

卵母細胞由于體積較大，細胞內水分較多、膜的滲透性較低，冷凍保護劑和水分無法快速有效進出細胞；此外，卵母細胞具有獨特的亞細胞結構，其染色體直接暴露于細胞質中無核膜的保護，在冷凍和復蘇過程中產生的滲透壓變化極易導致DNA 及微管損傷［15］。因此，與胚胎冷凍相比卵母細胞冷凍的復蘇率更低，受精率及臨床結局更差［3］。玻璃化冷凍技術可使細胞內和細胞外環境迅速固化成玻璃狀態，不會形成冰晶導致細胞及核損傷，可獲得較慢速冷凍更高的復蘇率、受精率及胚胎種植率［16-17］；此外，采用ICSI 作為玻璃化冷凍卵母細胞的受精方法可以有效解決因冷凍導致的透明帶硬化和受精障礙問題，極大改善了卵母細胞凍融的臨床結局［2-3］。本研究采用玻璃化冷凍技術共凍存卵母細胞1 268 枚，凍融卵母細胞復蘇存活率為85.73%，與近期的報道相近（84%）［9，18-19］。同時，本研究的結果顯示，凍卵組的可移植胚胎率、種植率、妊娠率、活產率與對照組均無顯著性差異，表明卵母細胞凍融并不影響其發育潛能，可獲得與新鮮卵母細胞相近的臨床結局［9，20-21］。有學者發現［22］，冷凍和復蘇過程可導致卵母細胞DNA 斷裂、紡錘體和細胞器損傷及卵子老化。本研究中凍卵組的卵裂率和優質胚胎率均顯著低于對照組，無可移植胚胎周期率顯著高于對照組，提示玻璃化冷凍和復蘇過程仍可能對卵母細胞造成一定的損傷。

卵母細胞凍融及臨床應用的安全性是不可忽視的問題。研究表明，玻璃化冷凍卵母細胞出生的1 027 名兒童與使用新鮮卵母細胞出生的1 224 名兒童相比，其產科結局（糖尿病、高血壓、早產）、分娩時孕周、出生體重、出生缺陷率、Apgar 評分及圍產期死亡率差異均無統計學意義［23］。進一步研究表明，凍融卵母細胞胚胎的非整倍體率與新鮮卵母細胞來源胚胎的非整倍體率相似［24］。本研究的結果顯示，凍卵組的流產率、異位妊娠率及活產率與對照組間均無顯著性差異；共31 例分娩患者中，平均分娩孕周、平均新生兒出生體重及出生缺陷率均與對照組間無顯著性差異。但尚缺乏對凍融卵母細胞出生子代長期隨訪的數據，其遠期安全性仍需進一步研究證實。

綜上所述，筆者所在中心的研究結果表明，卵母細胞冷凍可獲得與新鮮卵母細胞相近的臨床結局，可作為取卵日各種原因導致取精失敗的ART補救措施。同時對IVF 過程中部分年輕且獲卵數較多的患者凍存部分卵母細胞，不僅可為患者本人提供生育保險，而且可為有贈卵需求的不孕患者提供較高質量的卵源。基于本研究樣本量較少、且為回顧性分析，卵母細胞玻璃化冷凍技術的安全性、可行性及臨床價值仍需大樣本、多中心RCT 研究進一步證實。