1株鉤狀木霉SX005的鑒定及其復合制劑對黃瓜和辣椒苗生長的影響

張鋒濤 張成 廖文敏 付崗 張重遠 侯巨梅 李培征 劉銅

摘? ? 要：通過形態學和分子生物學相結合的方法，明確木霉菌株SX005的分類地位，并以該菌株的分生孢子粉為原料，分別與氨基寡糖素、礦源黃腐酸鉀、殼寡糖、海藻精、FUNA-801進行復配，通過盆栽試驗測定其復合制劑對黃瓜和辣椒苗生長的影響。結果表明，木霉菌株SX005為鉤狀木霉菌;其5種木霉復配制劑均能促進黃瓜和辣椒苗地上部分生長，且比單獨施用木霉菌效果更好，其中氨基寡糖素與木霉菌復配的制劑對2種作物的地上部分生長促進效果最好，使黃瓜株高提高了172%，辣椒株高提高了59.56%。海藻精或殼寡糖與木霉菌復配的制劑可顯著增加黃瓜根質量，氨基寡糖素或礦源黃腐酸鉀與木霉菌復配制劑可顯著增加辣椒根質量。本研究將為鉤狀木霉SX005復合制劑應用提供技術支撐。

關鍵詞：黃瓜;辣椒;鉤狀木霉;SX005;促生

中圖分類號：S642.2+S641.3 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）02-023-07

Identification of Trichoderma hamatum SX005 and effects of its six compound preparation on the growth of cucumber and pepper seedlings

ZHANG Fengtao1， ZHANG Cheng1， LIAO Wenmin2， FU Gang3， ZHANG Chongyuan1， HOU Jumei1， LI Peizheng1， LIU Tong1

（1. Engineering Center of Agricultural Microbial Preparation Research and Development of Hainan （Hainan University）， Haikou 570228， Hainan， China;2. Haikou R & D Center of Guizhou Yibaiyi Biotechnology Co.， Ltd， Haikou 570100，Hainan， China;3. Institute of Plant Protection Research， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007，Guangxi， China）

Abstract： The classification status of Trichoderma strain SX005 was clarified through morphological characteristics combined with molecular biology ， and the growth-promoting function of its compound preparation on cucumber and pepper seedlings was evaluated by pot experiments with T. hamatum SX005 conidia as raw materials， compounded with amino oligosaccharide， potassium fulvic acid， chitooligosaccharide， seaweed extract and FUNA-801. Results showed that the Trichoderma strain SX005 was identified as T. hamatum based on the characteristics of morphology and molecular biology. The five Trichoderma preparations could promote the growth of cucumber and pepper seedlings， and the effect was better than that of Trichoderma alone. The mixure of amino oligosaccharide and Trichoderma had the best promotion effect on the above-ground growth of the two crops， the plant height of cucumber and pepper increased by 172% and 59.56% respectively. The mixture of seaweed extract or chitosan and Trichoderma could significantly increase the root weight of cucumber， aminooligosaccharide or mineral potassium fulvic acid combined with Trichoderma could significantly increase the root weight of pepper. This study will provide technical support for the application of T. hamatum SX005 compound.

Key words： Cucumber; Pepper; Trichoderma hamatum; SX005; Promoting growth

黃瓜和辣椒是我國重的要經濟作物，近年來，在設施栽培中過量施用化學肥料引起了土壤酸化、板結、重金屬污染和次生鹽漬化等問題，降低土壤肥力的同時污染生態環境[1-2]。而在肥料中添加含有特定功能的菌劑，制成微生物肥料可以抑制作物對重金屬、農藥的吸收，凈化和修復土壤，提高肥料利用率[3]。已有研究表明，在黃瓜和辣椒種植中施用微生物菌劑能顯著提高產量、降低作物發病率[4-6]。木霉菌（Trichoderma spp.）是廣泛存在于土壤、根圍、葉圍等自然生態環境中的一種真菌，它可以通過競爭、拮抗、重寄生和分泌次生代謝產物等方式抑制植物病原菌的生長，同時可以促進植物對養分的吸收利用，提高作物產量和品質，在現代綠色農業生產中被廣泛使用[7-11]。目前，在木霉菌制劑的開發研究中因厚垣孢子發酵條件困難而產量較少，分生孢子發酵方法簡單且產量高，所以市場上使用的生物制劑大多為通過固體發酵技術獲得的分生孢子制劑[12-14]。單一使用木霉菌分生孢子對作物的促生效果一般，而將木霉菌分生孢子與營養物質或植物生長調節劑復配使用可以對作物的促生抗病起到協同增效作用[15]。氨基寡糖素、礦源黃腐酸鉀、殼寡糖、海藻精等物質具有促進作物生長、抑制病原菌或誘導植物產生抗病性和提高作物產量和品質的作用，目前在農業生產中應用較為廣泛[16-19]。但這類物質與微生物菌劑復配的效果研究報道較少。

海南省綠色農用生物制劑創制工程研究中心通過分離獲得1株抑菌促生作用較好的木霉菌SX005，筆者擬通過形態學和分子生物學相結合的鑒定手段明確該菌株的分類地位，并將該菌株的分生孢子粉分別與氨基寡糖素、礦源黃腐酸鉀、殼寡糖、海藻精、FUNA-801進行復配，測定了5種木霉菌復合制劑對黃瓜和辣椒苗生長的影響，以期獲得對黃瓜和辣椒苗促生作用較好的新型木霉菌復合制劑，為進一步開發利用木霉菌提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試培養基與試劑 PDA培養基：馬鈴薯200 g;葡萄糖15 g;瓊脂15 g;蒸餾水1 000 mL。

SNA培養基：KH2PO4 1.0 g;KCl 0.5 g;KNO3 1.0 g;MgSO4 0.5 g;葡萄糖0.2 g;蔗糖0.2 g;瓊脂18 g;蒸餾水1 000 mL。

CTAB、DNA提取液（V酚∶V氯仿∶V異戊醇=25∶24∶1）、異戊醇、β-巰基乙醇、70%乙醇均購自于天根生化科技（北京）有限公司。

ProDis MC9、Wgwin DKF潤濕劑、LT-8601潤濕增強劑、元明粉、白炭黑均購于深圳市朗鈦生物科技有限公司;礦源黃腐酸鉀購于鄭州銀之海化工產品有限公司;氨基寡糖素、殼寡糖由青島中科興海生物有限公司提供;海藻精由北京勁善勁美農業科技有限公司提供，FUNA-801（0.1%）由鄭州信聯生化科技有限公司提供。

1.1.2 供試菌株與作物 木霉菌SX005來源于海南海口白沙門附近海泥樣品，經選擇性培養基PDAm分離所得，保藏于海南省綠色農用生物制劑創制工程研究中心（海南大學）。黃瓜種子‘津豐A108購自海南晨鋒種業有限公司;辣椒種子‘熱辣4號由中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所提供，黃瓜和辣椒苗由中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所第五農場大隊培育。

1.1.3 育苗基質 育苗基質由泥炭、椰糠、炭化稻谷殼、蛭石組成，pH值為7.52，堿解氮質量分數112.81 mg·kg-1，有效磷質量分數48.06 mg·kg-1，速效鉀質量分數374.95 mg·kg-1，有機質質量分數2.93%，購自廣州市生升農業有限公司。

1.2 方法

1.2.1 木霉菌形態學觀察 將木霉菌株SX005從低溫甘油轉接到PDA平板上于28 ℃活化3 d，用6 mm打孔器沿菌絲生長邊緣打成菌餅，將其接種于SNA培養基平板中心，培養7 d后觀察其菌落形態、分生孢子、分生孢子梗及瓶梗的形態特征，參考Jaklitsch & Voglmayr[20]木霉菌分類方法進行鑒定。

1.2.2 木霉菌分子鑒定 將木霉菌株SX005培養5 d后，刮取菌絲，采用CTAB法提取基因組DNA。以基因組為模板，利用上游引物（5'-TGGGGWGAYCAR AARAAGG-3）和下游引物（5'-CATRATGACSGAATCTTCCTGG-3）通過PCR技術擴增rpb2基因。其PCR擴增體系如下：基因組模板1.0 μL，正向引物和反向引物各1.0 μL、preMix 12.5.0 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR擴增反應條件如下：94 ℃預變性4 min;94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min 15 s，共35循環，最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經1.2%（w）瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切取其目的基因片段，與Ti質粒連接，挑取陽性克隆送至廣州基迪奧公司測序。SX005的rpb2基因序列已提交至NCBI的Genbank數據庫（登錄號 MW148290.1）。

使用DNAMAN軟件將測序獲得的rpb2基因進行拼接[21]，后提交至NCBI數據庫進行BLAST同源比對分析，選擇NCBI refseq數據庫中的Hypocreales肉座目的12個同源性較高的rpb2序列（XM_006966461.1，XM_008600692.1，XM_008602683.1，XM_018804915.1，XM_023578311.1，XM_0311648- 34.1，XM_035463193.1，XM_031222262.1，XM_031185185.1，XM_031209139.1，XM_018898279.1，XM_018390099.1），使用Mafft軟件進行多序列比對[22]。另外，使用HMMER 3.1基于隱馬爾科夫 HMM模型，在擁有全基因組的木霉菌種中尋找rpb2代表性的同源序列（E值設定為1E-20）[23]。使用Mafft軟件進行多序列比對，Gblocks軟件選取保守區域[24]，Jmodeltest軟件選擇最佳的替代模型[25]，Iqtree軟件進行基于最大似然法的進化樹的構建[26]，最大似然法的boostrap值設置為1 000。所有用于建樹的序列，都提交至MEME在線網站（http：//meme-suite.org/）來驗證其保守序列[27]。

1.2.3 木霉菌孢子粉及復合制劑制備 將鉤狀木霉SX005孢子懸浮液（濃度為1.0×108 CFU·mL-1）按0.5%的接種量接種于已滅菌的發酵基質中，發酵基質由麥麩、玉米粉、稻殼、硅藻土按體積比6.8∶0.5∶1.7∶1混合組成、含水量45%。利用淺盤固體發酵技術[28]在28 ℃條件下發酵10 d，之后將其風干、粉碎、過篩得到鉤狀木霉SX005的分生孢子粉（1.5×1011 CFU·g-1）。將得到的SX005分生孢子粉分別與氨基寡糖素、礦源黃腐酸鉀、殼寡糖、海藻精、FUNA-801進行復配。

助劑組合體系如下：白炭黑60 g，ProDis MC9 60 g，Wgwin DKF潤濕劑10 g，LT-8601潤濕增強劑160 g，元明粉90 g。

1.2.4 促生試驗 促生試驗于2019年11月在中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所第五農場大隊中進行。將黃瓜和辣椒種子用55 ℃溫湯浸種的方法進行消毒，自然冷卻晾干后播種育苗。待黃瓜苗長到二葉期、辣椒長到六葉期時，挑取長勢一致的健康幼苗移栽到直徑為12 cm的育苗盆中，澆定根水。試驗采用隨機區組設計，共設計7個處理，每個處理50株苗，3次重復，將單一木霉菌T1、復合制劑T2～T6與水以1∶300的體積比配制成T1～T6稀釋液，在移栽第2天分別灌根處理，每株苗灌100 mL稀釋液，移栽后7 d分別以同樣的稀釋液對植株進行第2次灌根處理，同時進行1次葉噴處理。對照組以100 mL清水處理。在第2次灌根處理后7 d，使用標尺調查植株苗的株高、根長，使用分析天平稱量地上部分鮮質量、根鮮質量、并將根在105 ℃將根烘干至恒重后稱量其干質量。

1.3 數據分析

使用顯微鏡奧林巴斯BX53進行木霉菌顯微形態的拍攝，使用Adobe Photoshop CC 2017進行圖片的拼接，采用Excel 2003和SPSS 21.0軟件對數據進行統計分析。采用Duncan法進行方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 木霉菌株SX005的形態學鑒定

木霉菌株SX005在SNA培養基上生長較慢，菌絲稀疏，生長3 d時半徑為19.8 mm，4 d時形成少量灰綠色產孢簇，輪狀排列，7 d時長滿平板（圖1-A）;分生孢子呈球形（圖1-B），厚垣孢子為綠色，呈球形或橢球形（圖1-C）。木霉菌株SX005在SNA培養基上無色素和明顯氣味，菌絲具有長的主軸，側分支呈現較短的分叉;瓶梗呈現單生、對生或3個輪生，呈燒瓶形或安瓿形（圖1-D～F）。以上木霉菌株SX005的形態特征與鉤狀木霉菌形態特征相似，因此推測該菌株為鉤狀木霉。

2.2 木霉菌株SX005的分子鑒定

為進一步確定該菌株是否屬于鉤狀木霉菌，試驗采用保守引物擴增了大約1.2 kb的rpb2基因片段，經回收克隆獲得了1 294 bp的rpb2序列。基于Mafft軟件的多序列比對結果，使用Gblocks軟件，進行保守區域選擇，共有707個建樹簡約位點被用于后續分析。使用Jmodeltest軟件，進行替代模型選擇，根據矯正后的池氏信息準則AICc，選擇TIM2+G作為最優替代模型，使用iqtree軟件進行基于最大似然法的進化樹構建。

由圖2可知，rpb2序列經過MEME軟件保守結構域分析后，都具有10種保守的motif序列結構，相似的motif保守結構組成為系統發育分析結果準確性提供了更可靠的證據。在系統發育樹中，木霉種歸于8個進化枝，與目前已知的木霉菌系統進化關系描述一致。其中，Longibrachiatum Clade包括T. ghanense， T. longibrachiatum， T. saturnisporum和T. citrinoviride; Lutea Clade包括T. brevicompactum; Semiorbis Clade包括T. semiorbis; Harzianum Clade包括T. harzianum，T. afroharzianum和T. pleurotum; Stomoticum Clade包括T. rossicum; Pachybasioides Clade包括T. polysporum，T. parapiluliferum和T. piluliferum; Viride Clade包括T. atroviride， T. koningii， T. viridescens， T. paraviridescens， T. pararogersonii和T. gamsii; Hamatum Clade包括T. asperellum和T. hamatum;而木霉菌株SX005在系統發育樹中，與T. hamatum屬于同一分支，具有較高的同源性，推測該木霉菌屬于鉤狀木霉，結合2.1中形態學特征鑒定，明確木霉菌SX005為鉤狀木霉。

2.3 木霉菌株SX005及其不同復合制劑對黃瓜生長的影響

由表2可知，施用木霉菌復合制劑均能顯著促進黃瓜苗地上部分生長，且比單獨施用木霉菌（T1）對株高及地上部鮮質量的促進效果更好。T2處理對黃瓜株高的促進效果最好，株高達57.42 cm，比對照提高了172%，且顯著高于其他復合制劑處理;T2與T3處理對地上部分鮮質量促進作用最大，且二者之間沒有顯著差異。施用木霉菌復合制劑黃瓜根長均低于對照，且T2與T3處理根長與對照差異顯著;除T2外，施用木霉菌復合制劑黃瓜根鮮質量均高于對照，且T6處理根鮮質量最大，為0.94 g，較CK顯著提高了77.36%;各處理根干質量均高于對照，T1、T2及T3處理根干質量與對照無顯著差異，T4、T5、T6根干質量與對照差異顯著，其中T5處理根干質量最大，為0.14 g，較CK增加了100%。

2.4 木霉菌株SX005及其不同復合制劑對辣椒生長的影響

由表3可知，施用木霉菌復合制劑能顯著促進辣椒苗地上部分生長，所有處理組株高和地上部鮮質量均顯著高于CK與T1。其中T2處理辣椒幼苗株高值最大，為38.07 cm，較CK提高了59.56%;T2處理組地上部鮮質量最大，為6.82 g，較CK提高了145.32%。與對照相比，各處理均促進了根長生長，僅T1處理對辣椒幼苗根長的促進效果顯著，而5種木霉復配制劑對根長影響較小，與CK之間差異不顯著; T2、T3處理根干、鮮質量均顯著高于CK，并優于其他木霉菌復合制劑處理，其中T2處理根鮮質量最大，達2.33 g，較CK提高了92.56%，T3根干質量最大，為0.29 g，較CK增加了45%。

3 討論與結論

木霉菌是農業生產中應用最為廣泛的生防菌之一，不僅可以防治植物病害，還可以促進植物根系對肥料的吸收，進而促進作物生長。因此，進一步開發木霉菌，將木霉菌與肥料等物質復配使用可獲得更佳的促生效果[29]。李瑞霞等[30]研究發現，減施25%化肥同時配施木霉菌有機肥能改善土壤可耕種性，提高番茄的品質與產量。王曉婷[31]將哈茨木霉制劑與化肥配施可顯著改良土壤性質，促進玉米、絲瓜、茄子的生長。張子穎等[32]研究發現綠色木霉與高碳基肥料配施可促進烤煙生長發育、降低發病率、提升烤煙品質。楊力凡[33]將深綠木霉突變菌株與秸稈腐熟發酵制成生物有機肥處理黃瓜，發現其株高、鮮質量、干質量均高于對照。陳立華[34]和黃新琦[35]也發現哈茨木霉有機肥可顯著促進黃瓜植株生長。

氨基寡糖素是從海洋生物外殼中得到的一種寡糖類新型生物農藥，具有防治植物病害、促進細胞活化、刺激植物生長的作用[36]。張洪山等[37]將氨基寡糖素作為葉面肥噴施于辣椒幼苗上，發現能顯著促進植株的生長發育。彭昌家等[38]發現氨基寡糖素會促進辣椒的營養生長、株高增高和分枝增多，但同時也抑制生殖生長，減少果實的產量。礦源黃腐酸是一種從天然腐植酸中提取的短碳鏈分子結構物質，可以螯合鉀離子，使作物對鉀的吸收增加30%，還可以調節作物生理代謝，促進植物根際細菌、真菌、放線菌的繁殖，提高土壤生物多樣性[39-40]。這與本試驗中木霉菌復配制劑促進黃瓜和辣椒地上部分生長的結果一致。研究表明，氨基寡糖素或礦源黃腐酸鉀與木霉菌復配均能較好地促進黃瓜和辣椒地上部分的生長，其中，氨基寡糖素與木霉菌復配更能促進黃瓜株高生長，而礦源黃腐酸鉀與木霉菌復配則更有利于黃瓜地上部分鮮質量的增加。氨基寡糖素與木霉菌復配對辣椒幼苗株高及地上部分鮮質量均有較好的促生效果。因而，對于黃瓜、辣椒等以果實為主的作物，可將氨基寡糖素、礦源黃腐酸鉀與木霉菌復配施用，以提高果實產量，但對此分析還缺乏復配增產試驗的驗證。

在根系生長方面，木霉菌復配制劑5種處理的黃瓜根長均低于CK和單一使用木霉菌，而黃瓜根干質量均高于對照;木霉菌復配制劑5種處理辣椒根長、根干鮮質量均高于CK。氨基寡糖素或礦源黃腐酸鉀與木霉菌復配施用的辣椒干、鮮質量均高于FUNA-801（0.1%）、殼寡糖、海藻精的復配制劑，而對黃瓜根干、鮮質量的促進效果則表現相反。劉彩云等[41]發現含有綠色木霉的復合微生物發酵后與黃腐酸鉀復配可顯著促進水稻莖的生長，但對于水稻根長有一定抑制作用。這與本研究木霉菌復合制劑對黃瓜根長的抑制效果相近。在木霉菌復配試驗中，對黃瓜根系促進效果最好是海藻精或殼寡糖與木霉菌復配。海藻精含有K、Ca、Mg、Fe、Zn等多種礦物質元素和維生素，同時含有細胞分裂素、生長素、酚類、甜菜堿等生長調節物質，可以促進根系發育， 刺激根莖對土壤養分的吸收[42]。陳保宇[43]將海藻精與微生物菌劑復配施用促進了水稻對氮磷鉀等養分的吸收，提高了分蘗能力并取得良好的增產效果。殼聚糖是甲殼素的脫乙酰產物，具有活化土壤、促進種子萌發、提高作物抗逆性等多種作用[44]。于明革等[45]研究發現殼聚糖抑制了黃瓜根系的頂端優勢，但改善了根的組成，提高了根系的吸收和合成能力。試驗中還發現海藻精與木霉菌復配施用在抑制黃瓜根長的同時，還能促進側根發育，大幅度增加根質量。

綜上所述，在黃瓜栽培過程中，可在根系較弱時施用海藻精或殼寡糖與木霉菌的復配制劑，在苗期施用礦源黃腐酸鉀或氨基寡糖素與木霉菌的復配制劑。在辣椒栽培過程中，則推薦施用礦源黃腐酸鉀與木霉菌復配制劑。

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