大麻FT同源基因CsHd3a的克隆及表達譜分析

李 錚，潘 根，陶 杰，黃思齊，唐慧娟，鄧 勇，趙立寧，李德芳

(中國農業科學院 麻類研究所，湖南 長沙 410205)

植物開花時間是影響作物產量的關鍵因素之一，是植物由營養生長轉向生殖生長的標志，花期調控是植物生產中重要的一環[1]。誘導植物成花至少有6條途徑：光周期途徑、春化途徑、赤霉素途徑、自主途徑、年齡依賴途徑和溫敏途徑等。當環境發生變化(光周期、激素、溫度等)，這些途徑將植物體內各種因子產生的響應信號轉換成新信號后，傳遞給開花整合子，由它促進花分生組織特異基因的表達，誘導花的形成[2]。FLOWERINGLOCUST(FT)基因是6種途徑中最重要的開花整合子之一，也是重要的開花促進基因，對植物成花起著至關重要的作用[3]。研究報道，擬南芥的FT基因突變會導致植株開花推遲，過表達則早開花[4]。在水稻中，Headingdate3a(Hd3a)基因與擬南芥的FT基因具有同源性[5]，二者屬于磷脂酰乙醇胺結合蛋白(PEBP)家族的FT-Like(FTL)亞家族[6]，在植物中主要參與成花調控、花器官發育等，短日照下具有促進開花的功能。研究表明，擬南芥和水稻等植物在接受合適的光周期誘導后，FTL在葉中被誘導表達，其蛋白質由葉片經過維管束移動到莖頂端組織促進開花[6]。開花提前或延后嚴重影響了植物的產量和質量，因此，研究FT基因的功能及機理具有重要的理論和實際意義。前人在擬南芥、水稻、小麥、大豆等植物中已成功克隆FT基因家族，并對其遺傳因素和分子機制都有深入的研究，但大麻的開花機理尚不明確，大麻開花關鍵基因的研究鮮見報道。

大麻(Cannabissativa)是大麻科(Cannabinaceae)大麻屬(CannabisL.)一年生草本植物。大麻在中國栽培歷史久遠，且廣泛種植于世界各地，其纖維主要作為優良的紡織和造紙原料[7]；其種子可榨油，作食用油或工業用油[8]；其葉、花、果實等可入藥，近年來研究表明，大麻中的非成癮成分大麻二酚(CBD)有治療癲癇、失眠癥、焦慮、腫瘤等的功效[9-11]；還可用于預防或治療藥物成癮；甚至可以添加在化妝品中，對皮膚有舒緩修復、祛痘、抗皺等作用[12]。大麻的價值主要來源于其莖、葉和花中，但由于其屬于短日照植物，對光照變化十分敏感[13]，南種北移后生育期延長，出現晚花、無法收獲種子或種子結實不飽滿等現象[14]，收獲期延后也增加了人工成本；北種南引后生育期大大縮短，出現早花或植株發育不良等情況，纖維及花葉產量大大減少[15]。因此，培育大麻廣適應品種是當前大麻育種的熱點之一，而大麻開花期機理研究可為其提供理論支撐，但目前光周期影響大麻開花的分子機理尚不明確，限制了其在大麻育種中的應用。

本研究以云麻7號(Y7)和慶麻1號(Q1)為材料，通過對大麻FT同源基因CsHd3a(CannabissativaHeadingdate-3a)基因進行生物信息學分析、實時熒光定量對其進行組織和長、短日照下相對表達水平分析，為探索CsHd3a轉錄因子的開花調控機制提供理論依據，為培育大麻廣適應性品種奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與處理方法

本試驗中的大麻品種慶麻1號(Q1)和云麻7號(Y7)皆由中國農業科學院麻類研究所一年生麻類作物育種團隊提供。選取大小均勻、顆粒飽滿的種子，于濕潤的吸水紙上發芽。

1.1.1 大麻植株培養 待第一對真葉展開后，挑選若干發芽的植株移植室外培養，挑選3株長勢均勻的開花雌株，各取發育良好且長勢均勻的植物組織，迅速放入液氮，用于提取RNA。其余Q1和Y7植株采用盆栽方式放在自然條件下進行種植，待開花后記錄其開花期。

1.1.2 不同日照時長的處理 待發出第1對真葉后，移栽至花盆中，放入人工氣候室培養(溫度25～28 ℃，濕度70%，光照12 h/d)。培養30 d后，選取長勢均勻的Y7和Q1植株各6盆，均分為長日照組和短日照組，放置于植物組織培養室進行定時光照培養。長日照組光照時間為每日5：00-21：00，光照時長16 h，黑暗處理8 h；短日照組光照時間為每日8：00-16：00，光照時長8 h，黑暗處理16 h。連續處理7 d后，從00：00開始取樣，每隔4 h取一次，到20：00結束，共取6次。取樣時，皆選取頂部向下2，3節的葉片，且每次2個品種各取3株，取樣后迅速放入液氮冷凍后-80 ℃保存。

1.2 RNA提取

使用EASY spin Plus多糖多酚復雜植物總RNA快速提取試劑盒(艾德萊生物有限公司，北京)提取總RNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和純度，用Nano Drop 2000超微量分光光度計(Thermo Fisher Scientific，USA)檢測其濃度和純度。

1.3 引物設計

根據美國國家生物技術信息中心(NCBI)最新公布的大麻轉錄組序列信息，使用Primer 5.0進行引物設計(表1)，由北京擎科生物技術有限公司合成序列。

1.4 大麻CsHd3a基因的克隆

選取植物頂部向下第2，3節的葉片，提取大麻總RNA，使用金牌逆轉錄試劑盒(擎科生物技術有限公司，北京)反轉錄合成cDNA，以1 μL反轉錄產物為模板進行PCR擴增，PCR反應體系：2×TaqPCR Mix 12.5 μL，Primer-F(10 mol/mL)1 μL，Primer-R(10 mol/mL)1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 補至25 μL。反應程序：94 ℃ 3 min； 94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環30次； 72 ℃ 5 min，反應于12 ℃終止后取出，進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并對目的片段進行切膠回收。選擇T載體進行載體連接，并轉入DH5α感受態細胞培養，涂布于含有氨芐(Ampicillin)抗生素的LB平板上進行菌落篩選，挑菌培養并做陽性檢驗后，提取質粒并送至北京擎科生物有限公司測序。得到序列后進入NCBI的Blast模塊進行序列比對鑒定，并使用DNAMAN與CsHd3a基因的ORF序列進行比對。

1.5 大麻CsHd3a基因生物信息學分析

通過NCBI中公布的序列，獲得CsHd3a基因序列信息，使用BioXM 2.7軟件翻譯成氨基酸序列。在exPASy-ProteParam網站(https：//web.expasy.org/protparam/)中分析大麻CsHd3a蛋白一級結構的理化特性，包括氨基酸組成、分子量、親/疏水性、等電點及脂肪指數等。利用SOPMA工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預測二級結構，Phyre2(http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)預測三級結構。利用NCBI的保守域數據庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)檢索保守域并進行分析。通過NCBI獲取其他主要作物的FT及同源氨基酸序列信息，使用MEGA 7軟件以最大釋然法構建系統進化發育樹并進行分析。使用DNAMAN軟件進行氨基酸序列比對。

1.6 表達量分析

選取植物頂部向下第2，3節的葉片，提取大麻總RNA，使用Evo M-MLV反轉錄試劑預混液(湖南艾科瑞生物有限公司，長沙)反轉錄合成cDNA，選取DHS2作為內參基因(表1)，使用CFX96定量PCR儀(Bio-Rad，USA)采用qRT-PCR(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction)技術，選擇SYBRR Green Ⅰ染料，采用相對定量法研究Q1雌株中CsHd3a基因在盛花期不同部位的表達特征和CsHd3a基因在Q1、Y7中長、短日照下的表達特征。

表1 本研究所用引物Tab.1 Primers used in this study

2 結果與分析

2.1 大麻CsHd3a3基因的克隆

根據NCBI中公布的大麻FT同源基因序列設計PCR特異性引物，以Q1葉片為模板進行PCR擴增，通過擴增及瓊脂糖凝膠電泳驗證(圖1)，回收目的條帶后，克隆到pTOPO-Blunt平末端連接載體后，轉入感受態細胞，經過抗性篩選、陽性檢驗后進行測序分析，測序結果與NCBI中公布的大麻FT同源基因序列進行氨基酸序列比對一致。其全長CDS序列大小為543 bp，編碼180個氨基酸長度的蛋白質，將其命名為CsHd3a。利用DNAMAN軟件將Q1克隆出的CDS氨基酸序列與NCBI中公布的大麻FT同源基因序列進行比對，一致性為99.44%(圖2)，Q1中編碼區第8位氨基酸亮氨酸被替換為脯氨酸。

2.2 大麻CsHd3a蛋白理化特性分析

利用exPASy-ProteParam軟件對序列進行預測，CsHd3a蛋白分子式為C900H1387N251O269S5，ORF編碼的氨基酸數為180 aa；分子量為20.187 73 ku，理論等電點為7.76，脂肪族指數為30.33，親、疏水性平均值為-0.418，為較親水的兩性蛋白。利用CDD數據庫比對發現，CsHd3a蛋白共含有6個位置略有差異的結構域，其中含有PEBP-euk特殊結構域，屬于PEBP家族蛋白(圖3)。

CsHd3a蛋白預測的二級結構分析如圖4所示，編碼該蛋白的180個氨基酸中可能有25個氨基酸形成α螺旋(13.89%)，49個氨基酸形成延伸鏈(27.22%)，9個氨基酸形成β轉角(5.00%),97個氨基酸形成無規則卷曲(53.89%)。利用Phyre2工具進行三級結構預測，結果與二級結構預測結果相一致(圖5)。

在NCBI中獲得大麻與主要作物[16]的FT-Like蛋白序列，使用DNAMAN進行保守序列比對(圖6)。分析發現，氨基酸序列一致性為71.63%，說明FT氨基酸在不同物種間具有高度的相似性。使用MEGA 7的最大釋然法構建物種間的FT基因發育進化樹(圖7)，結果顯示，CsHd3a與棉花FT同源基因GhFT1親緣關系最近。

2.3 大麻CsHd3a基因的組織特異性表達分析

為探究CsHd3a基因在大麻中的組織表達特異性，選用慶麻1號(Q1)為材料，分析其在同一生長時期不同組織中基因的表達情況。如圖8所示，可看出CsHd3a基因在葉和花中均有表達，且在葉中高表達，在根和莖中幾乎不表達。在葉中的表達量是花的14.9倍，是根的155.3倍，是莖的389.7倍。

2.4 大麻不同品種的CsHd3a基因在長、短日照下的表達特征

為進一步探究CsHd3a在調控大麻開花中的作用，基于前人研究報道，選用北方品種Q1和南方品種Y7進行長、短日照下不同品種大麻CsHd3a基因在葉中表達情況的研究。同時播種35 d后，Y7依舊處于營養生長階段； Q1已停止營養生長轉入生殖生長(圖9)，Q1開花期明顯早于Y7。

選擇將2個品種分別以長(16 h光照)、短(8 h光照)日照處理。處理7 d后，從0：00開始到當日20：00，每隔4 h取樣一次，僅選取處理后的葉片組織。通過時空表達模式圖(圖10)可看出，在短日照處理下，Q1表達量皆高于Y7，且在白天(光照時間為8：00-16：00)表達量明顯升高，8：00達到峰值；在Q1植物中，該基因在短日照處理下白天表達量顯著上升，而在長日照中幾乎不表達；Q1在LD下和Y7在SD下，相對表達量皆低于0.2。

2.5 大麻不同品種CsHd3a基因的克隆

為探究早花品種Q1和晚花品種Y7在短日條件下的差異，利用DNAMAN軟件將Y7和Q1克隆出的CDS氨基酸序列進行比對，一致性為97.22%(圖11)。Y7蛋白序列存在5處位點發生氨基酸替換，分別是第9位纈氨酸被替換為丙氨酸；第40位甘氨酸被替換為絲氨酸；第42位谷氨酸被替換為甘氨酸；第46位絲氨酸被替換為脯氨酸；第55位天冬氨酸被替換為甘氨酸(圖12)。

3 結論與討論

開花期是重要的生育時期之一，決定大麻營養生長期的長短和不同品種的地域適應性，間接影響了大麻產量和質量，因此，研究大麻光周期調控基因對大麻的實際生產和優良品種培育具有重要意義。研究認為，光周期是影響開花最重要的環境因素之一[17]。植物在感知到有利的或誘導性的日長后，葉片中產生一種稱為熒光素的可移動的長途信號，后被傳送至莖尖，從而觸發花形態的發生，而FT基因mRNA是熒光素信號的重要組成部分[18]。FT在植物開花調控中的作用備受關注，近年來，研究者通過克隆、轉基因等分子技術對FT及同源基因進行功能驗證，研究發現，在水稻[19]、擬南芥[20]、小麥[21]、大豆[22]、玉米[23]中，其開花功能相當保守，即使發生突變仍能在合適的光照誘導下促進開花；使用基因沉默等技術使其功能失活則延遲開花。FT及其同源基因在多種作物中相繼被克隆，但目前尚未見有關大麻FT及同源基因的報道。

本研究從大麻品種Q1中克隆了FT同源基因，命名為CsHd3a基因，其cDNA編碼區與GenBank數據庫一致性高于99%，保守序列無差異，預測的二級結構和三級結構幾乎一致。對大麻CsHd3a蛋白進行生物信息學分析，發現其屬于親水性的不穩定蛋白質，無跨膜結構域，屬于非跨膜蛋白。CsHd3a蛋白屬于PEBP家族的FT-L亞家族，含有相當保守的PEBP結構域，在植物中被證實其家族基因的存在對激活器官狀結構(例如芽和花)的發育存在明顯的關系[24]，與其他植物的同源基因比對也有較高的相似度。在不同作物中，FT及其同源基因個數不同，如擬南芥[25]有2個、水稻[6]有25個、大豆[26]有24個。通過FT物種間進化發育樹分析，發現擬南芥的AtFT基因與同源基因AtFTL基因的親緣關系較遠，表明同一物種FT家族序列可能存在差異；大麻CsHd3a基因與同為短日照作物的水稻Hd3a基因的親緣關系較遠，其與長日照作物棉花的GhFTL基因親緣關系較近。同時說明FT的分布具有種屬特異性，這也解釋了FT及其同源基因在不同物種中行使的功能有所不同，如促進成色[27]、過表達抑制開花、作為細胞自主調節的計時器準確開閉氣孔保衛細胞[28]等。

FT及其同源基因是植物成花過程中關鍵基因，在葉片中高表達后傳遞熒光素至莖尖，促進成花。CsHd3a基因在開花期的大麻中組織表達量差異較大，其在葉片中表達量最高，花中次之，在莖與根系中幾乎不表達，這與前人的研究相一致[29]。Y7和Q1在長、短日照下CsHd3a基因的時空表達表明，Y7在短日照下相對表達量低于0.2，Q1在短日照處理下呈現高表達，且顯著高于Y7和長日條件下的Q1。推測Q1在短日照下表現早花與CsHd3a基因高表達有關，在短日照下的成花調控中扮演了重要角色。擬南芥中FT基因突變或不表達導致晚花或不開花，過表達導致植株早花[25]，這與本研究相一致，可見CsHd3a基因在大麻成花過程中可能發揮正向調控的作用。

進一步序列分析表明，在開花期有顯著差異的Q1和Y7品種中，其CsHd3a存在多處氨基酸差異，這些差異是否直接影響大麻開花期還有待進一步考證。在水稻中，Kasalath和日本晴等位基因在編碼區內有兩處堿基替換，從而改變該蛋白羧基端的氨基酸[30]，但這2種等位基因均具有促花功能[31]。水稻Hd3a基因是與可促進擬南芥開花的FT基因高度相似的基因，該基因在日照時長由長變短時誘導表達。在短日條件下，Hd3a轉錄水平對水稻抽穗期有直接影響，且Kasalath等位基因表達的mRNA早于日本晴等位基因，表達水平也較高[32]。

綜上所述，本研究克隆了大麻的FT同源基因CsHd3a基因，對其序列信息及蛋白結構進行預測和分析，該蛋白屬于參與開花調控的PEBP家族蛋白；并在開花期對其進行不同組織器官的表達進行分析，該基因在花和葉中都有表達，葉中相對表達量最高，在根和莖中幾乎不表達。同時對該基因的時空表達特性進行了研究，該基因在短日照處理下Q1相對表達量顯著上調，Y7幾乎不表達，結合短日照下Q1表現早花，可推測該基因在短日照下高表達導致開花。進一步克隆得到Y7和Q1序列，比對發現Y7存在5處氨基酸差異，可為進一步探究其調控大麻成花及花發育的分子機制奠定基礎。